论文部分内容阅读
研究背景:HBV是高变异的DNA病毒,其基因组是长约3.2 kb的部分双链环状DNA分子。HBV基因组上的变异包括点突变、缺失突变和移码突变等。缺失突变可发生在基因组不同编码框架中,HBV核心基因的内部缺失(core internal deletion,CID)突变体也有报道。HBV CID突变体可能改变HBV的生物学及致病性质。因此,调查江西地区慢性乙肝感染者的HBV CID突变体的流行情况,分析其基本生物学性质,对于进一步认识HBV致病性有重要意义。研究目的:初步研究江西地区慢性乙型肝炎患者HBV CID突变体的流行率,阐明HBV CID突变体的分子特征。构建HBV CID突变体的真核表达质粒,将其转染肝癌Hep G2细胞,观察HBV CID突变体表达产物的分泌特征,并初步阐述HBV CID突变体对宿主细胞非折叠蛋白反应的调节作用,进一步认识HBV致病的复杂性。研究方法:1.于2014,10-2015,6,从南昌大学第二附属医院门诊检验科收集189例慢性乙型肝炎患者HBs Ag阳性血清作为研究材料,提取病人血清中的HBV DNA。2.采用PCR技术扩增HBV基因组中长约840 bp的C基因DNA片段,命名为HBV-C,其包含Enh II+BCP+Pre C+C基因,产物电泳,目的条带回收、纯化并进行测序。3.利用Clustal X和Bioedit软件将所获得的HBV C区基因核苷酸和氨基酸序列与参考序列进行比对,分析缺失突变位点,以及HBV CID突变株的流行率。4.选取一例含有CID突变的变异株,PCR大量扩增,产物电泳,收集标准片段和缺失片段,将其克隆至真核表达质粒p Bud CE4.1中,构建真核表达载体p Bud CE4.1-HBV-C和p Bud CE4.1-HBV-CID,双酶切及测序鉴定。5.质粒p Bud CE4.1-HBV-C、p Bud CE4.1-HBV-CID以及p Bud CE4.1空质粒转染Hep G2细胞48 h后,收集细胞培养液以及细胞裂解液,ELISA检测其中HBe Ag的表达。6.提取p Bud CE4.1-HBV-C、p Bud CE4.1-HBV-CID以及p Bud CE4.1DNA转染Hep G2细胞后24 h、48 h和72 h时相点的总RNA,RT-PCR检测与非折叠蛋白反应相关蛋白ATF4、ATF6、XBP1-s和GRP78的m RNA的表达。研究结果:1.189份的HBs Ag阳性感染者的平均年龄为48±6.51岁,男性102人(53.97%),女性87人(46.03%)。2.HBV C区基因PCR扩增结果显示,7例标本中扩增出含840 bp和700 bp左右大小的二条带,序列比对发现840 bp产物为完整C区基因,即含Enh II-BCP-Pre C-C基因的完整序列,而700 bp产物出现了C区基因内部缺失突变,为HBV CID突变体。3.HBV CID突变体序列与HBV C区基因序列比对结果显示,7例HBV CID突变体的缺失区域分别位于nt2152-2265、nt2132-2239、nt2163-2306、nt2179-2283、nt2131-2247、nt2151-2252、nt2180-2203/nt2255-2332。4.7例HBV CID突变体氨基酸缺失区域分别位于aa84-121、aa78-113、aa89-136、aa94-128、aa78-116、aa84-117、aa94-101/aa119-144,分别导致b1/b2/c2/t3、b1/b2/c2/t3、b1/b2/b3/c2/t3、b2/c2/t3、b1/b2/c2/t3、b1/b2/c2/t3和b3/c2/t3免疫位点的丢失。5.质粒DNA双酶切及DNA测序结果证实,重组质粒p Bud CE4.1-HBV-C和p Bud CE4.1-HBV-CID构建成功,分别携带有840 bp和700 bp大小的目的基因。6.ELISA检测质粒转染的Hep G2细胞中HBe Ag表达结果显示,p Bud CE4.1-HBV-C组的细胞培养液和细胞裂解液中HBe Ag的表达量最高,显著高于p Bud CE4.1空载体组和p Bud CE4.1-HBV-CID转染组(P<0.05)。p Bud CE4.1-HBV-CID转染组的细胞裂解液中可检测到较低水平的HBe Ag表达,在培养液中未检测到HBe Ag表达。7.RT-PCR结果显示,p Bud CE4.1-HBV-CID组的ATF4、ATF6、XBP1-s、GRP78基因m RNA的表达量显著高于p Bud CE4.1对照组和p Bud CE4.1-HBV-C组(P<0.05)。结论:1.江西地区慢性乙肝患者中存在HBV CID突变体的流行,初步调查结果显示流行率为3.7%。2.在本地区发现的HBV CID突变体的缺失为编码框架内缺失,缺失区域主要位于nt2131-2306区域。3.HBV CID突变体(aa78-136)可能会导致某些具有免疫优势的表位缺失,从而造成免疫逃避现象,这可能导致乙型肝炎慢性化和持续化的一个重要机制。4.所发现的HBV CID突变体缺失的氨基酸序列未破坏HBV核心蛋白参与病毒衣壳组装的结构域。5.HBV CID突变体的表达产物空间折叠构像可能不同于HBV C基因表达的HBe Ag,是HBV CID突变体表达产物不能分泌的一种机制。6.HBV CID突变体明显激活UPR反应相关蛋白的表达,说明HBV CID突变体参与细胞UPR反应的调节作用。