目的：　　近年来，纳米材料在口腔种植体方面的应用研究越来越受到重视，其中种植体材料纳米表面结构特征及其对成骨细胞的影响，已成为国内外研究的热点。利用阳极氧化法，设定不同的实验参数，在纯钛表面制备出不同管径的纳米管氧化膜并研究其对成骨细胞的影响尤其受到关注。不过，相关研究结论至今尚存在争议。　　Ti2448合金，是中科院金属所自主开发出的一款β型钛合金，其弹性模量远远低于纯钛及传统的α+β型钛合金Ti6Al4V,更接近皮质骨与牙本质，经研究证明其力学性能及生物相容性优于纯钛，是一种极具应用前景的种植体材料。本课题通过阳极氧化法，设定不同的实验参数，在其表面制备出不同管径的纳米管阵列氧化膜，分析其表征并进一步研究不同管径氧化膜的生物活性，筛选出最适管径，为新型种植体材料的开发及临床应用提供理论基础。　　方法：　　1、材料制备　　在室温下，将Ti2448合金做阳极，不锈钢容器作阴极，含1摩尔/升(NH4)2SO4，0.15摩尔/升NH4F，pH值约为6～7的水溶液为电解质，采用逐步升压法、设定四组不同的实验参数进行阳极氧化。　　2、扫描电镜观测试样表面氧化膜　　试样表面预先喷金处理后，扫描电镜观测各组表面微观形貌、纳米管直径大小，并将氧化膜刮下粘于导电胶上，观测各实验组表面氧化膜的厚度。　　3、能谱分析　　利用X射线能谱仪(EDX)对各实验组及对照组表面元素成分进行半定量分析。　　4、接触角、表面能检测　　采用静滴接触角/界面张力测量仪测量各实验组及对照组试样的接触角，并计算其表面能。　　5、细胞培养　　复苏后的MG-63细胞加入培养基，在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下静置培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，2-3天换液，细胞长至80％融合时，进行传代。　　6、实验材料分组　　对照组:Ti2448合金;实验组:阳极氧化处理后，具有相同厚度，不同管径纳米管氧化膜的Ti2448合金。具体分为:30nm组、50 nm组、70 nm组、90 nm组。　　7、MTT实验　　将MG-63细胞接种于铺有钛合金片的24孔板中，于接种后1h、3h、24h、4天、7天将各孔内试样漂洗后移入一块新的24孔板，每孔加300μl培养液，30μlMTT液，培养4h，吸弃各孔培养液，每孔加入500μl二甲亚砜，振摇10分钟，将各孔内待测液移入酶标板，用酶联免疫检测仪在570nm波长测定各组OD值。　　8、免疫荧光观察　　细胞接种方法同MTT实验，于接种后1h、3h、24h将各孔内试样漂洗后移入一块新的24孔板，4％甲醛室温固定30min，0.2％Triton-Ⅹ-100透化2min，5％BSA室温封闭30min，5ug/ml FITC标记的毒伞素室温避光染色1h，25ug/ml PI室温避光染色1min，共聚焦激光扫描显微镜采集图像。　　9、扫描电镜观察　　选择对照组、30nm组、90nm组试样（直径10mm，厚1mm），细胞接种方法同MTT实验，于接种后48h将各孔内试样漂洗后移入一块新的24孔板，2.5％戊二醛在4℃固定2h，4℃预冷的1％锇酸，4℃固定1h，依次乙醇系列梯度脱水、CO2临界点干燥、喷金后，在热场发射扫描电子显微镜下观察材料表面细胞形态及对蛋白的吸附。　　10、流式细胞仪检测　　将MG-63细胞接种于铺有钛合金片的6孔板中，于接种后48h，将各孔内试样漂洗后移入一块新的6孔板，收集细胞，70％冰乙醇固定30min，碘化丙啶(PI)染色30min，流式细胞仪分析DNA周期，计算各组细胞增殖指数。　　11、ALP活性检测　　细胞接种、培养同MTT实验，于接种后4天、11天、18天，将各组试样漂洗后移入一块新的24孔板，1％TritonⅩ-100裂解，4℃过夜，取适量裂解液，利用考马斯亮兰法测定其蛋白浓度，利用PNPP法，于405nm波长测定各组OD值。计算各组的OD值/μg蛋白。　　12、Real Time RT-PCR法检测　　选择对照组、30nm组、90nm组试样（直径10mm，厚1mm），将MG-63细胞接种于铺有各组试样的6孔板中，于接种后3h、24h、7天、14天、21天，将各孔内试样漂洗后移入一块新的6孔板，收集细胞，提取并检测总RNA，Real TimeRT-PCR法检测3h、24h，整合素β1、桩蛋白基因mRNA的相对表达及7天、14天、21天，CoL-Ⅰ、OC、OPN基因mRNA的相对表达。　　13、统计学分析　　用SPSS16.0软件对各组数据进行单因素方差分析，并采用LSD检验进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果：　　1、扫描电镜观测试样表面氧化膜　　随着氧化电压的升高，试样表面纳米管的直径也增大，实验1-4组材料表面分别生成30nm、50nm、70nm、90nm内径的纳米管氧化膜。各实验组在设定参数下生成的纳米管氧化膜厚度基本一致。　　2、能谱分析　　经阳极氧化处理后，材料表面主要含Ti、Nb、Zr、Sn、O元素，各实验组表面成分一致。　　3、接触角、表面能检测　　各实验组试样与水的接触角显著小于对照组(p＜0.05);70nm、90nm组试样与水的接触角显著小于30nm、50nm组(p＜0.05)。　　4、MTT实验　　细胞接种1h，各实验组OD值与对照组差异无显著性;细胞接种3h，30nm组OD值显著高于对照组及其它实验组(p＜0.05)，50nm组、70nm组、90nm组OD值与对照组差异无显著性;细胞接种24h，30nm组OD值显著高于对照组及其它实验组(p＜0.01)，50nm组、70nm组、90nm组OD值与对照组差异无显著性;细胞接种4天，30nm组OD值显著高于对照组及其它实验组(p＜0.01)，90nm组OD值显著低于对照组及其它实验组(p＜0.05);细胞接种7天，50nm组、70nm组、90nm组OD值显著低于对照组(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.01)。　　5、免疫荧光观察　　1h时，各组试样表面的细胞形态差异不明显;3h、24h时，30nm组细胞铺展范围大于对照组及其它实验组;随着试样表面纳米管直径的增加，细胞铺展范围呈下降趋势。　　6、扫描电镜观察　　与对照组相比，30nm组试样表面黏附的细胞贴壁性更好;90nm组试样表面黏附的细胞贴壁性很差，可见多处明显翘起的边缘，细胞扭曲;30nm组试样表面，细胞外基质蛋白可覆盖管口，90nm组试样表面，细胞外基质蛋白很难黏附并覆盖整个管口。　　7、流式细胞仪检测　　细胞接种48h后，50nm组、70nm组、90nm组细胞增殖指数显著低于对照组(p＜0.05)。　　8、ALP活性检测　　细胞接种培养4天后，30nm组OD值/μg蛋白显著高于对照组(p＜0.01)，其它实验组与对照组差异无显著性;细胞接种培养11天后，30nm组OD值/μg蛋白显著高于对照组(p＜0.01)，70nm组、90nm组OD值/μg蛋白显著低于对照组(p＜0.01);细胞接种培养18天后，30nm组OD值/μg蛋白显著低于对照组(p＜0.01)，50nm组OD值/μg蛋白显著高于对照组(p＜0.05)，70nm组、90nm组OD值/μg蛋白显著高于对照组(p＜0.01)。　　9、Real Time RT-PCR检测　　β1-integrin基因mRNA相对表达在3h时，90nm组显著低于对照组(p＜0.01)，30nm组与对照组无显著性差异;24h时，30nm组显著高于对照组(p＜0.01)，90nm组显著低于对照组(p＜0.01)。桩蛋白基因mRNA相对表达在3h、24h各组均无显著性差异;各组细胞其细胞外基质蛋白表达的时间特异性基本一致，30nm组CoL-Ⅰ、OC、OPN基因mRNA相对表达总体上高于对照组，90nm组CoL-Ⅰ、OC、OPN基因mRNA相对表达总体上低于对照组。　　结论：　　1、通过阳极氧化法，设定不同的实验参数，在Ti2448合金表面成功制备出了表面化学成分一致、厚度相同、管径不同的纳米管阵列氧化膜。　　2、经阳极氧化后，试样表面接触角减小、表面能增加、亲水性增加，并且随着表面制备的纳米管管径的增加，试样表面表面能、亲水性有增加趋势。　　3、材料表面局部形态对成骨细胞早期黏附的影响要强于接触角、表面能的影响。　　4、与对照组相比，较小(30nm)管径的纳米管氧化膜更有利于成骨细胞的早期黏附;较大(90nm)管径的纳米管氧化膜不利于成骨细胞的早期黏附　　5、与对照组相比，较小(30nm)管径的纳米管氧化膜更有利于成骨细胞的增殖、分化;较大(90nm)管径的纳米管氧化膜反而不利于成骨细胞的增殖、分化。