光敏蛋白KillerRed的纯化及其基因工程菌培养条件优化

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光活化农药与传统农药相比具有廉价、高效、无污染等优越性。光活化农药的关键是光敏剂,在有光和氧存在条件下光敏剂催化产生单线态氧,杀灭害虫。 目前所使用的光活化农药主要是小分子化合物如染料类,卟啉类。且其来源主要是通过化学合成,成本较高。蛋白质来源于生物,生物源蛋白光敏物质作为光活化农药使用,具有与环境相容性好,易于降解等优点。KillerRed是一种新型的蛋白光敏剂,具有显著的光活化毒性。 本研究构建了工程菌DH5α/pKillerRed-B,得到了新型的蛋白光敏剂KillerRed,并对其光活化特性进行了初步研究。 报道了重组大肠杆菌表达的KillerRed蛋白的下游生产工艺研究,并对产物进行了分析,鉴定构建DH5α/pKillerRed-B工程菌;纯化前先将获得的菌体超声破碎,然后经硫酸铵沉淀、凝胶层析和离子交换层析三步纯化,接着对纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE、等电点分析。得到纯度为96%以上KillerRed蛋白的制品。 分别对摇瓶培养因素中不同pH值、不同浓度IPTG对菌体生长的影响、酵母膏与蛋白胨比例对菌体生长的影响进行单因素分析,发现pH值为6.5时生长好,随着IPTG浓度的升高,抑制作用有所增强,改变LB培养基的组成,对重组大肠杆菌的生长没有影响。 测定KillerRed对白纹伊蚊4龄幼虫的半数致死浓度。KillerRed对白纹伊蚊4龄幼虫的LC50值为0.92mg/mL,在绿光下,KillerRed具有光活化杀虫活性。观察KillerRed对白纹伊蚊成蚊毒杀作用。KillerRed致白纹伊蚊成虫的累计死亡率,实验组与对照组之间无差别。KillerRed对白纹伊蚊成蚊的毒杀作用不明显。 KillerRed处理Hi-5细胞,用MTT法检测绿光(540-580nm)照射后细胞存活率。结果表明KillerRed在绿光照射下对Hi-5细胞IC50为135.30μg/mL,而黑暗条件下无明显抑制作用,显示出很好的光活化活性。 KillerRed具有良好的光活化活性,同时可以通过培养基因工程菌的方式大量获得,成本较低,具有开发成新型光活化杀虫剂的前景。
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