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第一部分动物模型的建立目的：研究呼吸道合胞病毒非结构蛋白(RSV NS)对BALB/c小鼠气道的影响,首先需要建立RSV及RSVNS在小鼠体内正常表达的模型。拟通过滴鼻方法对小鼠进行RSV感染和RSVNS重组质粒的转染,并分别予以不同剂量的重组质粒对小鼠进行转染,从中选出最佳转染剂量,为后续实验奠定基础。方法：首先通过病毒复苏、增殖,收获并准备滴度为1×107PFU/ml的RSV病毒液,同时提取本课题组前期已成功构建的RSV重组表达质粒pNS1和pNS2,然后将RSV50μl及2μg/4μg/8μg三个不同剂量的RSV NS重组质粒pNS1和pNS2对BALB/c小鼠进行滴鼻,建立RSV感染和RSV NS质粒转染的小鼠模型。在滴鼻后第1、3、5、7天,将各组小鼠脱臼处死后,无菌解剖取材双肺,左肺经4%多聚甲醛固定后,行HE染色和免疫组化检测,以确定模型是否构建成功。结果：(1)所提取的重组质粒pNS1和pNS2经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,可见目的基因表达。(2)RSV感染小鼠后,小鼠肺组织病理学分析显示肺组织发生严重的炎症反应；免疫组化检测免疫组化检测表明可见RSV抗原阳性表达。(3)重组质粒转染小鼠后,小鼠肺组织病理学分析显示肺组织发生严重的炎症反应;免疫组化检测表明可见pNS1-flag和pNS2-HA抗原阳性表达,且与转染质粒剂量呈正相关。结论：通过滴鼻方法对小鼠进行RSV感染和RSV NS重组质粒转染,模型构建成功。质粒转染组中质粒的表达具有一定的剂量依赖性,故选择4μg为每只小鼠的最佳转染剂量,进行后续实验研究。模型构建的成功,为后续RSV NS蛋白的体内实验奠定了基础。第二部分呼吸道合胞病毒非结构蛋白对小鼠具有致病作用目的：研究呼吸道合胞病毒非结构蛋白(RSVNS)对BALB/c小鼠的作用以及对干扰素信号和调节性T细胞的调控作用。方法：提取本课题组前期已成功构建的RSV重组表达质粒pNS1和pNS2,然后将8μg/4μg/μg三个不同剂量的RSV NS重组质粒pNS1和pNS2对BALB/c小鼠进行滴鼻。在滴鼻后第1、3、5、7天,将各组小鼠脱臼处死后,无菌解剖取材双肺和脾脏,左肺经4%多聚甲醛固定后,行HE染色和免疫组化检测；右肺匀浆行RNA提取及qRT-PCR扩增,蛋白提取及免疫印迹实验；脾脏用于制备单个核细胞悬液及流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg).结果：(1)重组质粒转染小鼠后,小鼠一般情况发生改变,体重下降明显。(2)NS1对小鼠体内IFN-β及Mxl表达呈现抑制作用,NS2仅在早期短暂抑制两者表达,后期则呈现上调的作用。(3)NSl和NS2可上调小鼠体内SOCS1表达。(4)NS1可抑制CD4+CD25+Foxp3+ Treg分化表达,NS2则表现为早期抑制,后期促进的作用。结论：RSV NS可对小鼠造成致病效应,且该效应是通过对其内源性干扰素的抑制来发挥拮抗宿主抗病毒免疫效应以及与免疫抑制性CD4+CD25+Foxp3+Treg的相互作用实现的。第三部分 抑制非结构蛋白对RSV感染小鼠气道炎症反应的控制目的：研究抑制呼吸道合胞病毒非结构蛋白(RSV NS)对RSV感染BALB/c小鼠气道炎症反应的控制以及相关作用机制。方法：首先通过病毒复苏、增殖,收获并准备滴度为1×107PFU/ml的RSV病毒液,并按指定序列合成针对RSVNS蛋白的siRNA。在对BALB/c小鼠进行滴鼻攻毒前,分别予以siNS1和siNS2进行干预。在滴鼻后第1、3、5、7天,将各组小鼠脱臼处死后,无菌解剖取材双肺和脾脏,左肺经4%多聚甲醛固定后,行HE染色和免疫组化检测；右肺匀浆行蛋白提取及免疫印迹实验。结果：(1)RSV感染小鼠后,小鼠一般情况发生改变,体重下降明显；予以siRNA提前干预的小鼠,与RSV阳性对照组相比,体重明显增高。(2)予以siNS1和siNS2进行提前干预的小鼠,其肺部平均光密度与RSV阳性对照相比,有显著性下降。(3)予以siNS1和siNS2进行提前干预的小鼠,其肺部炎症反应程度与RSV阳性对照组相比,显著减轻。(4)siRNA-NS可明显抑制RSV感染小鼠肺组织SOCS1表达。结论：抑制RSVNS蛋白可减轻RSV感染小鼠的气道炎症反应,NS蛋白可以作为防治RSV感染的潜在靶点。