藜麦原产于南美洲安第斯山区,具有很高的食用价值,是目前公认的适宜人类食用的“全营养食品”。近些年才开始在全球其他地区得到推广和种植,我国目前已经在山西、西藏、四川、青海等地实现规划化种植。静乐自2011年试种成功以来发展迅速,被称为“中国藜麦之乡”。本文以山西静乐藜麦为原料,对其中的多糖进行分离纯化,采用多种方法分析了多糖结构与分子形貌,研究其抗氧化活性与体内免疫活性,从而为开发利用藜麦多糖提供了理论依据。(1)采用酶解协同超声波联合方法提取藜麦中多糖,以多糖提取率为指标,经试验确定最佳辅助酶为纤维素酶,最优添加量为3%。在单因素试验的基础上,进行响应面试验,结果表明,藜麦多糖最优提取工艺为:超声温度65℃、超声时间18 min、料液比1:33(g/mL),此时藜麦多糖的提取率为68.08%,与理论值70.78%接近。酶具有量少而催化效率高的特点,能够加速多糖溶出,有效降低生产成本;超声波产生空化作用,使细胞破碎,细胞内溶物更好地溶出。酶法辅助超声波提取法可以明显提高藜麦多糖的提取率,通过对比试验表明,经酶法辅助超声波提取比单一采用超声波提取,多糖提取率增加1.5倍。(2)上述最优条件下提取的粗多糖首先采用α-淀粉酶将淀粉充分水解并通过透析除去水解产物,最终不再产生淀粉-碘反应为止。藜麦中蛋白含量丰富,使用中性蛋白酶水解蛋白,然后使用Sevag试剂(1-丁醇:氯仿,1:4)去除蛋白两次,重复这个过程直至中间层不再有白色物质产生。蛋白脱除率为79.85%,且多糖损失较少,达到较好的脱蛋白效果。柱层析是常用的纯化多糖的方法,去淀粉、脱蛋白后的粗多糖经DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析分离得到两个组分QPD1和QPD2,由于QPD2含量较少,后续只对QPD1进行研究,QPD1进一步经Sephadex G-50凝胶柱层析法分离纯化得脱蛋白的水溶性非淀粉精多糖(QPS1)。(3)多糖的结构决定其生物活性,单糖组成及比例、分子量大小、三螺旋结构等都决定着多糖生物活性的差异,采用FT-IR、NMR、HPGPC、HPLC、AFM、SEM、刚果红等方法对QPS1的结构及分子形貌进行表征,并对其活性表现与内在结构进行了阐释。高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测得其分子量为34.0 kDa,分子量分布单一,多糖纯度较高。高效液相色谱法(HPLC)测定其主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成,摩尔比为2.63:2.40:1.64:6.28:1.95:2.48:5.0。红外光谱图显示其具有多糖的特征吸收峰,是具有α-、β-两种糖苷健的吡喃型多糖。核磁图显示QPS1含有α-L-鼠李糖残基,且含有两种糖苷健,红外、核磁和高效液相色谱的结果具有一致性。刚果红实验表明,QPS1具有三螺旋结构,这一结构表现出特定的分子识别和较高的生物活性。原子力显微镜下观察到QPS1在水溶液中聚集成直径为8-14 nm的球形颗粒,互相缠绕,具有支链结构。扫描电镜下观察到QPS1有大量孔隙,具有良好的复水性能。(4)本实验采用不同的体外抗氧化模型反应机制对QPS1的体外抗氧化活性进行了综合评价。此外,有研究表明多糖的抗氧化活性主要取决于其理化性质,如单糖组成、分子量、链构象等。研究表明,抗氧化活性与单糖组成,特别是葡萄糖醛酸和葡萄糖的含量间存在高度的相关性。此外,多糖的分子量(Mw)对其生物活性有显著的影响,低分子量多糖比高分子量多糖具有更好的抗氧化作用。结果表明,分子量在4.0~100.0 kDa范围内的多糖具有较好的抗氧化活性。在本研究中,QPS1表现出一定的抗氧化活性,这可能与它的低分子量和单糖组成有关,因为它含有较高的葡萄糖含量。小鼠的体重和器官指数可以反映机体和免疫器官的恢复情况。巨噬细胞是人体免疫系统的第一道屏障,单核巨噬细胞吞噬作用可以表征机体的非特异性免疫。活化的巨噬细胞在抗原递送、抗感染和炎症反应中起重要作用。多项研究表明,多糖的刺激作用开始于细胞吞噬功能的增强。细胞因子主要由活化的巨噬细胞分泌,在细胞免疫过程中发挥重要作用,帮助清除异常细胞。DTH是一种由T淋巴细胞介导的细胞免疫,足趾厚度的测量通常被作为DTH试验的一部分来评估T细胞介导的免疫反应。QPS1在体内对细胞因子分泌、血清溶菌酶活性、单核-巨噬细胞吞噬、器官指数和迟发型超敏反应的免疫促进作用表明,QPS1可显著提升小鼠脾脏和胸腺指数,增加IFN-γ,IL-6,IFN-α,IgM和溶菌酶(LYSO)在血清中的分泌量,并对单核巨噬细胞的吞噬作用和迟发型超敏反应有一定的增强作用。