牛流行热（bovine ephemeral fever，BEF）是由牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）引起的一种急性传染病，首先发现于19世纪中期的东非，随后流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区。该病传播迅速，流行面广，有一定的周期性，曾在我国多个省份多次发生，导致奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成重大经济损失。BEFV有5种结构蛋白，其中G蛋白是主要的免疫原性蛋白，其表面存在5个抗原位点，G₁为BEFV所特有，只与牛流行热病毒阳性血消发生反应，而其它位点与同科的相关病毒则存在交叉反应，因此我们选取G₁抗原表位进行克隆表达和蛋白纯化。将得到的重组G₁蛋白作为包被抗原，建立检测BEF血清抗体的间接ELISA方法，开发相关的试剂盒，为该病的快速诊断和疫苗免疫后的抗体水平监测提供技术支持。本研究从BEF中国标准毒株JB76H株中提取总RNA，通过RT-PCR方法扩增G₁抗原表位目的基因。序列分析发现，克隆的G₁抗原表位基因与NCBI／GenBank上登载的台湾株的核苷酸同源性为96.4％，氨基酸同源性为96.5％；与澳大利亚株的核营酸同源性为89.1％，氨基酸同源性为90.8％。目的基因在GS115中得到胞外分泌的可溶性目的篮白，蛋白大小约为26.0kDa；在BL21（DE3）中得到主要以包涵体形式存在的重组蛋白，蛋白大小约为41.54kDa。经SDS-PAGE、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析，两种蛋白均具有良好的反应原性、免疫原性和特异性，可作为包被抗原，建立ELISA方法。以BL21（DE3）表达的重组蛋白作为包被抗原，经过各种反应条件的优化，建立了检测BEFV血清抗体的间接ELISA方法。本研究表明，抗原的最适包被浓度为0.574μg／孔；血清和酶标抗体的最佳稀释度分别为1：20和1：200；抗原包被后以37℃1h转入4℃过夜包被效果较好；封闭后以37℃1h、血清加入后以37℃1h、酶标抗体加入后以37℃1h反应，为ELISA最适反应温度和间隔时间。判定标准为：标准阴性血清对照孔OD₄₉₀值的平均值×2.1作为闽值，所测样品的OD₄₉₀值大于或等于阈值判为阳性，小于阈值判为阴性。该法有良好的敏感性、特异性和重复性，有临床实用价值。在毕赤酵母GS115中表达的可溶性目的蛋白作为包被抗原，也建立了间接ELISA方法。该方法敏感性和重复性较好，但特异性和符合性较差，其根本原因是目的蛋白纯度较低，必须有行之有效的纯化方法，该蛋白才有应用价值。本试验对ELISA试剂盒的开发作了初步研究。确定了试剂盒的组成成分，其保存条件、保存期、特异性、敏感性、符合性以及批内和批间的稳定性都有了可靠的检验数据，有望开发成可上市的试剂盒。