软脉煎对体外培养血管平滑肌细胞亡及斑块稳定性的影响

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目的:探讨ox-LDL诱导血管平滑肌细胞凋亡的最佳造模剂量和时间,观察补肾益气复方软脉煎对血管平滑肌细胞凋亡及凋亡通路关键因子caspase-3,斑块稳定性标志物属蛋白酶-2以及金属蛋白酶-9的影响。  方法:(1)确定最佳造模剂量和时间:A7r5细胞株(平滑肌细胞)传代至第4代,长到对数期(贴壁细胞长到80%融合时)用于实验研究。MTT法比较用不同浓度的ox-LDL分别作用24h、48h后平滑肌细胞生存状态,最终确定最佳造模剂量和作用时间。(2)药物血清制备:实验动物分成三组,分别用生理盐水,中药软脉煎汤剂,西药辛伐他汀溶液给雄性SD大鼠灌胃,喂药三天后,麻醉,取腹主动脉血,提取大鼠含药血清。(3)实验设立空白、模型、软脉煎低、中、剂量组和辛伐他汀组等六组。空白组取喂生理盐水大鼠血清培养液,模型组用含ox-LDL+DMEM培养液,其他各用药组在模型组的基础上在培养液中加入不同浓度、种类含药血清,不同培养液分别培养A7r5细胞24h后。(4)分别用免疫荧光法观察不同组别血管平滑肌细胞形态学变化,流式细胞仪观察不同组别血管平滑肌细胞的凋亡情况。Western-blot法测凋亡通路的关键酶caspase-3的表达。ELISA法测不同组别斑块稳定性指标MMP-2,MMP-9的表达。  结果:(1) ox-LDL诱导血管平滑肌细胞凋亡的最佳造模浓度为240ug/ml,最佳作用时间为24h。(2) Hoechst染色检测发现空白组荧光较均匀,未发现明显凋亡形态学特征,而经ox-LDL作用的各组细胞均表现出凋亡细胞的形态学特征,其中模型组的变化最为明显,各中药组及西药组变化居于前二者之间,高浓度组凋亡特征最不明显,与辛伐他汀组表现相近。(3)通过流式细胞术观察,空白组凋亡VSMCs最少,模型组细胞凋亡最多,低剂量组与模型组相当,随剂量增加,各软脉煎组细胞凋亡情况好转,辛伐他汀组与高剂量组细胞凋亡情况相当。将各组凋亡率减去空白组凋亡率后两两比较,与模型组比较,软脉煎低剂量组、软脉煎中剂量组、软脉煎高剂量组、辛伐他汀凋亡率有显著差异(p<0.01、p<0.001、p<0.001、p<0.001)。(4) Western-Blot法观察不同组别中caspase-3的表达发现空白组几乎不表达,模型组的表达最多,而软脉煎组和辛伐他汀组均明显少于模型组。(5) ELISA法测不同组别MMP-2发现与空白组组比较,模型组有明显差异(p<0.01)。与模型组比较,软脉煎低剂量组无差异(p>0.05),软脉煎中剂量组、软脉煎高剂量组、辛伐他汀有差异(p<0.05、p<0.01、p<0.01)。与辛伐他汀比较,软脉煎高剂量组无差异(p>0.05)。(6) ELISA法测不同组别MMP-9的表达,与空白组比较,模型组差异明显(p<0.01)。与模型组比较,软脉煎低剂量组、软脉煎中剂量组、软脉煎高剂量组、辛伐他汀有差异(p<0.05、p<0.01、p<0.01、p<0.01)。与辛伐他汀组比较软脉煎高剂量组没有差别(p>0.05)。  结论:软脉煎具有降低血管平滑肌细胞的凋亡,减少Caspase-3、MMP-2、MM-9的表达,维持斑块稳定性的作用,从而推断补肾益气法可能是有效治疗动脉粥样硬化的原则之一,从一个侧面验证中医“治病求本”的思想。
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