成骨肉瘤发病率为首位高发的原发性骨恶性肿瘤,早期表现隐匿而且早期即可发生转移,一直是骨科界的难题之一。上世纪70年代以来,随着新辅助化疗的应用,患者5年生存率已经达到近70%。但那些诊断较晚、发生转移及对化疗反应不明显的患者5年生存率仅为20-40%。困扰成骨肉瘤疗效的原因主要有：目前仍没有合适的肿瘤标志物,无法进行早期诊断,另外缺乏特异性治疗靶点。新世纪以来,随着差异蛋白质组学技术的发展,已经可以对细胞间差异蛋白质进行高通量筛检。在转录及修饰水平上对蛋白质进行差异组学研究对发现新的有价值的肿瘤标记物及治疗靶点至关重要。但由于成骨肉瘤蛋白质组极为复杂,低拷贝蛋白质及细胞膜蛋白质通常很难被检出,因此目前仅有为数不多的文献对成骨肉瘤组织或细胞系进行了蛋白质组学研究。近年来,蛋白质组学技术的发展更多关注于亚细胞组分。在各类亚细胞组分中,细胞膜作为细胞与内环境之间物质交流、能量与信息转换的关隘,具有重要的生物学作用。因此,对成骨肉瘤细胞膜蛋白质组学进行研究十分必要。材料和方法：1细胞培养(1)人类成骨肉瘤细胞系(MG-63)、成骨细胞系(hFOB1.19)培养于含5%C02,37℃加湿孵箱中；(2) hFOB1.19细胞用Ham’s F12及DMEM培养基(无酚红)1：1混合,加入L-谷氨酰胺(浓度2.5mmol/L)和G418(浓度0.3mg/mL)培养；(3)以10%FBS培养MG-63细胞。MG-63传代1次/2-3天,hFOB1.19传代1次／4-5天。2提取并鉴定细胞膜蛋白质(1)细胞膜提取前48h前去除G418以减少误差,每次实验取108个细胞。(2)细胞系对数生长期时,用PBS洗细胞3次,细胞刮刮下细胞后,以4℃,离心(1500g)6min,收集沉淀。(3)按照108/mL细胞将沉淀重悬于0.2mmol EDTA,1mmol NaHCO3中,4℃孵育0.5h,手动匀浆10次。离心(200g)取上清。(4)上清以4℃25000g离心0.5h。所得沉淀重悬于1mmol NaHCO3中,将2g重悬的沉淀加入6.6%葡聚糖T500,6.6%聚乙二醇3350,0.2M K3P04,pH7.2双水相系统。(5)4℃上下颠倒40次,4℃离心(750g)5min后,将富含细胞膜的上相取出加入到事先准备好另一管新鲜的下相中,同时,事先准备好的新鲜的上相加入到原来的下相中,两管分别上下振荡颠倒40次。(6)分别将两管上、下相收集合并,以1mmol NaHCO3(1:5)稀释,4℃下1×105g离心0.5h取沉淀,悬于1mL Na2CO3(pH11.3)孵育30mmin,1×105g离心0.5h后取沉淀。(7)再向上层和下层两管沉淀加入等体积的双向裂解液提取细胞膜蛋白质,冰上提取0.5h,室温提取0.5h,然后4℃,12000rpm离心0.5h取上清。(8)制备SDS-PAGE胶,细胞膜样品每孔上样50μg。分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为4.8%。浓缩胶电流为15mA,分离胶电流为25mA。准备PVDF膜,用转膜缓冲液(2.9g Tris、5.8g甘氨酸、0.37g SDS和200mL甲醇溶于双蒸水,定容至1000mL)浸泡15min。(9)电泳完毕后取下凝胶,置于转膜缓冲液中15min。按胶的大小切取PVDF膜和两块三层滤纸,形成三明治状。测量膜的面积,按1.5mA/cm2计算所需电流(恒流,电压不超过200V与功率不超过30W),转膜1h后,取出PVDF膜,置于封闭液中4℃过夜；(10)取出封闭后的膜,根据Na+/K+-ATP酶(112KDa)和Prohibitin(32KDa)抗原的分子量取均值,以72KDa为界将PVDF膜剪成两半。高分子量一半膜加入Na+/K+-ATP酶抗体。低分子量一半膜加入Prohibitin-1抗体(0.5ng/mL)。(11)摇床上振荡1h后,TBST溶液洗涤3次,每次5mmin。取出膜片,背面相靠放入新的小袋中,加入0.3ng用辣根过氧化物酶标记的二抗,置摇床上振荡反应45mmin。然后用TBST洗2次,再用TBS(50mL)洗1次,每次5mmin；(12)发光剂均匀涂于膜片上,在暗室中曝光3-5mmin,然后显影,等出现明显条带时,进行定影。3差异蛋白质标记及鉴定3.1iTRAQ标记定量分析蛋白质(1)两组样品各100ug,置于冰上,加入6倍体积预冷丙酮,-20℃沉淀211后,以12000rpm,4℃,离心20min。弃上清,沉淀中加入30ul样品溶解液,振荡充分溶解。按iTRAQ实验方案,还原样本蛋白、阻断半胱氨酸,按照酶：蛋白质=1：25的比例加入胰蛋白酶(Promega),37℃酶解过夜。(2)恢复iTRAQ试剂至室温,每份加入乙醇70μl,离心。取MG-63和hFOB1.19细胞膜样本各2份,分别加入iTRAQ试剂,涡旋离心,室温孵育1h。(3) iTRAQ实验进行2次,第一次MG-63标记为115报告离子,hFOB1.19标记为116报告离子；第二次差异MG-63标记为115报告离子,hFOB1.19标记为114报告离子。3.2离线强阳离子柱第一维分离iTRAQ标记的样品经Sep-Pak固相萃取柱(Waters, Germany)脱盐后,利用强阳离子交换(Strong Cation Exchange, SCX)色谱分离。SCX色谱柱：内径5μm,300A,0.5×23mm；流动相A相：10mmol KH2PO4,25%乙腈,pH2.8；流动相B相：10mmol KH2PO4,500mmol KCL,25%乙腈,pH2.8；线性梯度流速200μl/min洗脱60min。收集得到15种组分。3.3在线反向色谱质谱鉴定第二维分离分别蒸干SCX收集到的15段组分,溶解于0.1%甲酸溶液,在Qstar Pulsar上进行分析。多肽经液相色谱串联ZORBAX300SB-C18(5μm,300A,0.5×23mm, Waters)反相色谱柱在线富集,然后在线切换到PepMap反向色谱柱。PepMap反向色谱柱：内径75μm, LC Packings;.缓冲溶液A：5%乙腈,95%水,0.1%甲酸；缓冲溶液B：95%乙腈,5%水,0.1%甲酸流速是400nl/min,梯度洗脱：0-90min,A：5%-45%。样品通过在线连接的质谱仪进行串联质谱分析。质谱数据通过Analyst QS1.0软件自动获取。全谱(MS)扫描m/z范围400-1800,对离子强度最高的6个离子峰进行MS2扫描,m/z设为100-2000。对>30单位且带有2-4个电荷的两个最强峰进行裂解。气帘气体设为10,选用氮气作为碰撞气体,离子化顶端电压为4000V。3.4数据分析将串联质谱得到的质量标签数据导入蛋白质检测软件2.0.1(ABI.USA)软件,根据报告离子的峰面积积分进行相对定量分析,计算114.1,115.1和116.1报告离子的比值。离子的峰面积积分比值选择P≤0.05的结果进行报告,误差通过统计学偏畸值校正进行归一化处理。MS和MSn分子量允许误差为0.2Da。在IPI数据库中搜索肽段条件如下：1.半胱氨酸的甲烷硫代磺酸-甲酯修饰设为固定修饰；2.允许遗漏的胰酶酶切位点数为1个。所鉴定的蛋白质必须满足以下条件：1.报告置信度在95%以上(Protscore>1.3)的蛋白质；2.至少一条肽段对蛋白质鉴定的置信度高于95%；3.根据Shilov方法计算平均比值的真值,表示为误差因子EF(EF=1095%置信水平),EF<2的定量结果符合要求。此外,设定p value<0.05的蛋白定量结果为有意义。两细胞系同种蛋白质表达有显著性差异的阈值设定为>1.5倍或<0.66。3.5生物信息学分析通过软件计算获得理论等电点(PI),分子量(MW)和亲水性指数(GRAVY)等生物信息；通过检索Swiss-Prot/TrEMBL和Gene Ontology Database获得蛋白质亚细胞定位和功能；潜在跨膜区(TMHs, transmembrane helices)利用隐马尔可夫的跨膜蛋白算法模型(TMHMM, Transmembrane Hidden Markov Model)进行预测。已鉴定的胞膜蛋白的相互作用网络通过在STRING软件中输入IPI号码得到。结果：1细胞膜纯化及鉴定尽量统一MG63和hFOB1.19细胞的培养条件。细胞膜提取前至少培养1d。通过抗体标记的方法进行检测,发现细胞膜在双水相提取的上层组分中明显富集,线粒体的污染相对得到减少。经图像软件Image J分析,hFOB1.19和MG-63细胞系与对照相比,细胞膜组分在上相富集分别为11.2和15.3倍；在下相富集分别为6.5和3.9倍；线粒体组分在上相富集分别为1.2和1.4倍；在下相富集分别为6.9和6.3倍,细胞膜得到相对纯化。2差异细胞膜蛋白质鉴定整个实验共鉴定出342种非冗余细胞膜蛋白质。根据前述标准,共有63种差异差异蛋白质被鉴定,其中69.8%(44/63)位于细胞膜,其余位于细胞核(12.7%),细胞质(6.3%),内质网及高尔基体(1.6%)。6种差异蛋白质为新发现,没有在GO或UniProt数据库中注解。63种差异细胞膜蛋白中37%为跨膜蛋白,其中有10个以上跨膜区的蛋白为3种,有4个跨膜区的蛋白为1种,有2个跨膜区的蛋白为4种,11种蛋白质有1个跨膜区。所检出差异蛋白质参与了以下生物活动,即这些生物学过程在肿瘤细胞中改变：结合位点(30.8%),细胞结构(8.8%),信号转导(7.8%)。在63种差异蛋白中,第1次鉴定出22种,包括6种上调蛋白质和16种下调蛋白质(p-value<0.05);第2次鉴定出47种,包括6种上调蛋白质和41种下调蛋白质(p-value<0.05)。两次实验综合分析,鉴定出6种相同的蛋白质,其中2种为上调蛋白,4种为下调蛋白。细胞膜蛋白ITGβ1中3条肽段的特征性串联质谱被鉴定,序列中检出全部y或b离子。3生物信息学分析经String (http://string.embl.de)相互作用数据库检索后显示,所鉴定蛋白质参与了细胞能量代谢、信号识别等重要作用。ITGA2(整合素a-2前体)在OS细胞中表达下调；ITGβ1(整合素β-1前体)在OS细胞中表达下调；CTNNB1(胞浆钙紧张素β-1)在OS细胞中表达下调；CTNND1(胞浆钙紧张素δ-1)在OS细胞中表达下调。上述分子的变化将激活下游Wnt信号转导通路。结论：本课题首先通过双水相法提取到高丰度的细胞膜蛋白质,然后利用iTRAQ技术对差异蛋白质进行标记、最后应用MDLC-MSn技术相结合的方法对差异蛋白质进行鉴定,得出如下结论：1.双水相分离法使MG63细胞系与hFPB1.19细胞系膜蛋白质相对富集；2.经iTRAQ标记,MDLC-MSn联用可实现MG63细胞系与hFOB1.19细胞系差异性膜蛋白质的鉴定,这些蛋白质生物学功能重要且相互作用,其中ITGβ1可能成为重要的成骨肉瘤生物学标记；