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研究背景和目的线粒体在真核生物体内参与多种代谢过程及信号通路,其结构和功能受线粒体基因组和核基因组双重调控。线粒体基因组是长16569bp的双链闭合环状结构,由内环的轻链（light chain,L链）和外环的重链（heavy chain,H链）构成,线粒体基因组的37个基因紧密排列在L链和H链上。线粒体基因组结构裸露,易受到线粒体内膜上氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OXPHOS）产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）损害并发生基因突变。线粒体基因组中有7个线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）参与编码线粒体复合体Ⅰ（NADH泛醌氧化还原酶）亚基,分别是ND1-ND6和ND4L基因,其中ND1、ND4 和ND6基因突变是 Leber 遗传性视神经病（Leber’s hereditary optic neuropathy,LHON）最常见的病因。mtDNA突变可以引起线粒体结构和（或）功能障碍,ATP合成不足,导致高耗氧量的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）变性、丢失及视神经萎缩,从而产生LHON表型。目前已发现超过30种mtDNA突变可导致LHON,其中三个突变热点分别是m.3460G＞A、m.11778G＞A和m.14484T＞C突变。LHON的临床表现主要是急性或亚急性双眼无痛性视力下降和中心视野缺损。当患者临床表现不典型或没有明确的母系遗传家族史时,进行基因检测是明确诊断的重要方法。但意义未明的mtDNA变异并不能用来确定或排除LHON的诊断,因此对这些新发的或临床意义未明的线粒体变异位点进行致病性验证和致病机制研究,有助于完善线粒体病的临床表型谱和致病基因谱,进一步对线粒体病的诊断和治疗提供帮助。研究对象和方法通过对一个临床表型为LHON伴肌张力障碍的患者进行分子遗传学和分子生物学分析,探究该线粒体ND1基因m.4160T＞C变异的致病性及致病机制。首先完善该病例临床资料,并利用Sanger测序对患者进行家系验证和组织异质性分析。然后提取患者及家系成员的血小板作为外源性线粒体供体,利用人胸腺激酶缺陷细胞骨肉瘤细胞系（143B Thymidine kinase negative,143B TK-）作为核供体细胞,通过胞质杂交融合（cytoplasmic hybrid,cybrid）技术,构建cybrid细胞。运用单克隆筛选技术,选取携带m.4160T＞C的变异株和野生株分别作为变异组及对照组并进行检测,包括线粒体相关蛋白表达、线粒体呼吸链酶复合体活性及其介导的呼吸氧耗率和细胞水平呼吸氧耗率等指标,并对数据进行处理和分析。结果1.临床资料收集:眼科检查示双眼最佳矫正视力（best-corrected visual acuity,BCVA）均为1/20;光学相干断层扫描（optical coherence tomography,OCT）和光学相干断层扫描血管成像（optical coherence tomography angiography,OCTA）示视网膜神经纤维层（retinal nerve fiber layer,RNFL）变薄,放射状视盘周围毛细血管网（radial peripapillary capillaries,RPC）丢失、血流量明显下降;颅脑MRI示双侧基底节区及中脑导水管周围异常信号。2.遗传学分析:用尿沉渣进行线粒体基因组全长测序示患者携带m.4160T＞C变异。Sanger测序显示患者外周血、尿沉渣和口腔粘膜中,m.4160T＞C变异率分别为80.2%、90.8%和81.7%,患者母亲及姐姐该位点无变异。mtDNA及核苷酸序列保守性分析表明,线粒体4160位点在不同物种间高度保守,而m.4160T＞C变异将第285位的氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸（p.Leu285Pro）。3.蛋白表达检测:Western blotting显示变异组cybrid细胞中mtDNA编码的复合体I亚基 MT-ND1、MT-ND4、MT-ND5,复合体 V（ATP 合酶）亚基 MT-ATP6,nDNA编码亚基NDUFB8的蛋白表达水平明显低于对照组;而nDNA编码的复合体Ⅳ（细胞色素C氧化酶）亚基MT-CO1、复合体Ⅲ亚基UQCRC2和复合体V亚基ATP5A蛋白表达水平较对照组无明显差异。4.线粒体生化活性检测显示:变异组cybrid细胞线粒体复合体Ⅰ和复合体Ⅱ（琥珀酸脱氢酶）的酶活性显著降低,分别为对照组cybrid细胞的31.8%和74.4%（P值＜0.05）;5.细胞及线粒体呼吸功能检测显示:变异组cybrid细胞的基础呼吸氧耗率（oxygen consumption rate,OCR）、ATP相关呼吸OCR、最大呼吸OCR均显著降低,分别为对照组cybrid细胞的59.8%、57.7%、65.2%（P值＜0.05）;变异组cybrid细胞中线粒体复合体I及复合体Ⅱ介导的呼吸OCR明显下降,分别为后者的61.2%、52.5%（P＜0.05）,而复合体Ⅳ的呼吸OCR两者无明显差异（P值＞0.05）。结论线粒体ND1基因m.4160T＞C变异是致病性变异。该变异降低线粒体蛋白表达水平以及线粒体复合体I、复合体Ⅱ的酶活性,导致线粒体OXPHOS损害和ATP合成不足,从而引起高耗氧的视网膜神经节细胞和视神经能量代谢障碍,产生LHON表型。