【摘 要】
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在自然界中有一类最古老的酶,它是伴随DNA的产生而产生的,这就是DNA拓扑异构酶（topoisomerase,topo）。Topo是一类控制和修改双螺旋DNA复制和转录过程中的拓扑结构的酶,此酶最基本的细胞学功能是参与DNA复制、转录、染色质与染色体的转变以及基因组的稳定性。在生命体中此酶的活性发生变化会导致一系列生命过程的异常从而造成不能完成其生活史。在对二化性家蚕P33的自然突变体l-4i的相
【基金项目】
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国家自然科学基金（赵巧玲,No.31972616）；
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在自然界中有一类最古老的酶,它是伴随DNA的产生而产生的,这就是DNA拓扑异构酶（topoisomerase,topo）。Topo是一类控制和修改双螺旋DNA复制和转录过程中的拓扑结构的酶,此酶最基本的细胞学功能是参与DNA复制、转录、染色质与染色体的转变以及基因组的稳定性。在生命体中此酶的活性发生变化会导致一系列生命过程的异常从而造成不能完成其生活史。在对二化性家蚕P33的自然突变体l-4i的相关突变性状分析中前人已表明:l-4i食桑少,生长发育缓慢,不能完成整个生活史;遗传统计学分析认为常染色体上隐性纯合致死型单基因突变,图位克隆出突变基因为家蚕topo。在已初步认定topo基因突变为l-4i的形成原因时,关于拓扑异构酶（Bmtop3-alpha）的功能及l-4i形成的机制还有诸多亟待解决的问题:1.突变基因（Bmtop3α）的序列分析和蛋白表达。本文克隆出该基因完整序列,ORF长3051 bp,并与突变体作对比,发生突变的位点为第7外显子上有48 bp的缺失,且没有造成移码突变。将Bmtop3α基因插入原核表达载体中,经过诱导表达检测出有目的蛋白。2.Bmtop3-alpha蛋白的性质分析和纯化及其体外酶活性测定。经生理生化性质预测认为,Bmtop3-alpha蛋白为亲水性蛋白,有一定的可溶性,没有跨膜结构域和信号肽,在C端有一小肽的核定位信号。这些都与此酶的功能相符合——在细胞核中执行DNA解螺旋松弛和细胞复制等相关过程。经结构分析后截取核心功能区的表达并从包涵体中纯化出活性酶,解决了Bmtop3-alpha在多种原核和真核表达系统中均难以纯化出目的蛋白的难题。纯化的酶在体外松弛p BR322质粒,缺失16个氨基酸残基后的酶活性大大下降。3.突变体的组织细胞形态学分析。鉴于突变体形体小,发育缓慢,不能完成世代更替,由此认为突变体存在大量细胞凋亡事件。通过组织冷冻切片和tunel荧光,分析了平均光密度、累积光密度（IOD）、面积和直径这四个参数与凋亡率之间的关系,并进行了相关性分析。结果认为:在实验范围内对凋亡信号的检测,野生型家蚕没有明显的变化趋势,而突变体则越来越强,相关性分析结果得出IOD与凋亡率之间的皮尔逊相关性最大。4.利用RNA-Seq对突变体进行比较转录组学分析。突变体由于16氨基酸残基的缺失造成酶活性下降,并且检测有大量的细胞凋亡事件发生,仅凭这些还不能全面解释其表型机理。利用RNA-Seq的方法通过比较转录组学的分析,进行GO和KEGG代谢通路富集。在突变体中2013个下调表达的基因中显著富集了剪接体sn RNP组装、蛋白折叠和蛋白质分解代谢过程等多个生物学过程。2405个上调表达的基因中显著富集了排名靠前的若干个生物学过程,包括嘌呤碱基代谢过程、核苷代谢过程和从头合成IMP生物合成过程等。另外还在l-4i和P33之间发现了大量的差异RNA选择性剪接事件。分析表明,多种生物学过程和途径的失衡以及选择性剪接产生的异常蛋白可能导致突变体的差异表型。5.Bmtop3-alpha蛋白的两个重要通路和氨基酸进化同源性分析。通过对Bmtop3α基因的交并集分析,映射的KEGG通路中找到了突变体在范可尼贫血通路和同源重组两个通路中相关因子的表达量发生了明显的上下调变化。选择具有代表性的三个基因,对P33进行了RNAi分析后实验组家蚕中有出现了类似l-4i的生理性状发生,统计分析经多重比较得出实验组的体重也有达到了极显著差异变化（p＜0.0001）,q RT-PCR验证了相关基因的表达量下调表达。通过对基因结构变化、转录表达和蛋白水平这三个不同维度的研究,辅以组织形态学分析结果和RNAi技术,本文以比较系统的方式初步阐明了由于Bmtop3-alpha酶活性下降所引起的DNA复制、重组、转录和修复等过程异常,导致的基因组不稳定性,进而产生的一系列连锁反应累积造成l-4i突变体发育迟缓,进食少,机体衰竭而不能完成整个生活史的机制。
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