电针能治疗多种疼痛(包括躯体疼痛和内脏疼痛),对电针躯体镇痛的研究发现,电针可诱导多种镇痛物质(如脑啡肽、内啡肽、强啡肽等)和抗镇痛物质(如八肽胆囊收缩素、孤啡肽等)的释放。电针镇痛是中枢多种物质共同作用的结果。目前电针缓解内脏疼痛的研究进展缓慢,这主要是由于没有合适的模型。本研究旨在建立合适的内脏超敏模型,研究针刺缓解内脏超敏的中枢分子机制。电针在反刍动物(山羊)的镇痛效果最好,本研究电针试验拟在山羊上进行。由于山羊试验成本较高,本试验先建立大鼠内脏超敏模型,在此基础上再建立山羊回肠炎性内脏超敏模型。反复或持续电针会引起电针镇痛效应下降,产生“电针耐受”现象,电针耐受是电针治疗的负效应,是电针临床应用的主要障碍之一。研究表明抗镇痛性物质在电针耐受中发挥了重要的作用。近期的研究发现胸腺素β4(Tβ4)具有抗电针镇痛的作用,进一步探索Tβ4在电针耐受中的作用,以阐明电针耐受的机理。1.三硝基苯磺酸诱导回肠炎性内脏超敏模型的建立炎症性肠病(IBDs)是免疫介导的慢性、间歇性复发的肠道炎症。内脏超敏反应是IBDs的一个重要的病理生理机制,近几年受到越来越多的关注。70%的IBDs患者在疾病发展的急性期和恢复期,炎性介质持续释放,导致肠壁神经末梢敏感化,并引起腹痛。2/3的IBDs患者表现为回肠末端透壁性炎症。而现有的报道都是基于结肠炎而展开的,显然不太适合研究IBD引起的内脏超敏。IBD患者是否存在内脏超敏存在争议,并且缺乏证据。为解决这一争议,本试验旨在用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导大鼠回肠炎模型,并观察内脏超敏的存在。在此基础上,建立山羊回肠炎性内脏超敏模型。将雄性SD大鼠麻醉,打开腹腔,分别在距回肠末端15 cm处的肠腔注射TNBS(0.6 mL,80 mg/kg,溶于30%乙醇中),对照组注射等体积的30%乙醇或生理盐水。分别在第1、3、7、14、21和28天,评估大鼠在20、40、60、80和100 mmHg结直肠扩张压力(CRD)下的内脏运动反应(VMR)。CRD测试后,立即安乐死大鼠,采集回肠末段样品,ELISA法检测髓过氧化物酶(MPO)和细胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)含量;免疫组织化学法测定T11背根神经节中降钙素基因相关肽(CGRP)水平。结果显示:TNBS组大鼠在第3天开始表现透壁炎症,在第7天最明显,随后炎症逐渐恢复,在第21天未见明显病变。回肠炎大鼠CRD引起的VMR在第7~21天显著高于对照大鼠(P<0.05),背根神经节中CGRP免疫反应阳性细胞在第7~21天显著增加(P<0.05),且与大鼠VMR正相关。表明TNBS回肠腔注射,诱导了透壁回肠炎,并引发内脏超敏,该内脏超敏可持续到第21天。在此基础上,采用30 mg TNBS-40%乙醇溶液(1.2 mL)注射到山羊距回肠韧带15 cm处的回肠壁,对照组注射等量的生理盐水,在第3、7、14、21和28天评估山羊回肠炎症和内脏运动反应。结果显示TNBS在第3~7天诱导山羊明显的回肠炎症,回肠炎山羊内脏超敏在第7天开始出现,持续到第28天。该模型模拟了IBDs的临床表现,可为探讨肠道炎症和内脏超敏的发病机制提供思路,有助于进一步治疗内脏超敏。2.电针通过调节疼痛下行传导系统中JAK2/STAT3信号通路缓解山羊内脏超敏目前认为炎症、心理和肠道异常感觉和运动功能障碍等会导致外周和中枢敏感化,并引起内脏超敏,但其确切机制尚不完全清楚。细胞因子(如IL-6)激活的JAK2/STAT3信号通路是中枢敏化的关键信号通路,并促进了超敏反应的发生。因此,JAK2/STAT3信号通路可能是治疗人和动物超敏反应的潜在靶点。电针是一种传统中医治疗方法,安全且无并发症,可能成为治疗内脏超敏的一种有效辅助手段,但其具体机制尚不清楚。电针通过激活(或抑制)下行抑制(或易化)系统产生镇痛,该系统主要包括中脑导水管周围灰质(PAG)-延髓头端腹内侧区(RVM)-脊髓背角(SCDH)产生镇痛作用。电针是否通过PAG-RVM-SCDH轴的JAK2/STAT3信号通路调节内脏超敏有待证实。为探索电针治疗内脏超敏的效果及中枢机制,本试验建立山羊回肠炎性内脏超敏模型(1.2 mL,30 mg TNBS-40%乙醇溶液回肠壁注射),第7天开始每3 d用电针刺激内脏超敏山羊双侧“后三里”穴,每次30 min,共6次。在第7、10、13、16、19和22天记录山羊结直肠扩张(CRD)引起的疼痛行为反应和内脏运动反应(VMR)。第22天采集脑和T11脊髓,用免疫印迹和实时荧光定量PCR法检测脊髓中IL-6、JAK2和STAT3的蛋白和mRNA水平,免疫组化法观察这些物质在中脑导水管周围灰质腹外侧区(vlPAG)、RVM(主要是中缝大核,NRM)、SCDH、孤束核(NTS)和迷走运动背核(DMV)中的分布。结果显示:注射TNBS-乙醇溶液的山羊表现腹泻以及明显VMR和疼痛行为反应,vlPAG、NRM、NTS和DMV中IL-6及磷酸化JAK2(pJAK2)和STAT3(pSTAT3)水平增加,SCDH中这些物质的蛋白和mRNA水平增加。电针缓解山羊腹泻、VMR及疼痛行为反应,降低vlPAG、NRM、SCDH和NTS中IL-6、pJAK2和pSTAT3水平,减少DMV中IL-6和pJAK2水平,而不影响SCDH中这三种物质的mRNA水平。以上结果表明电针可能通过抑制PAG-RVM-SCDH中JAK2/STAT3信号通路缓解山羊内脏超敏。3.胸腺素β4参与慢性电针耐受适当间隔时间的电针能产生良好镇痛效果,但是反复或持续电针会引起电针镇痛效应下降,即产生“电针耐受”。电针耐受是电针治疗的一种负效应,引起了临床工作者和研究人员的极大关注。大量的研究表明电针在诱导阿片肽(如脑啡肽(ENK)、内啡肽(END)、强啡肽(DYN)等)释放,产生镇痛的同时,也引起抗阿片肽(如八肽胆囊收缩素(CCK-8)、孤啡肽(OFQ)等)的释放增加。尽管相关研究阐明了这些活性物质的作用及其相互间的关系,但电针耐受的具体机制仍不清楚。近期的研究发现Tβ4具有抗电针镇痛的作用,其抗电针镇痛的机理值得关注,且其在电针耐受中的作用及其与经典针刺镇痛相关的阿片肽类和抗阿片肽类及其受体等物质的关系值得研究。由于躯体镇痛模型容易复制,电针耐受的研究一般建立在躯体镇痛耐受的基础上。大鼠每天电针1次,每次30 min,连续8 d,建立电针耐受模型。侧脑室微注射Tβ4抗体或其siRNA以评估Tβ4对电针耐受的影响。观察Tβ4 siRNA注射后,各脑区(下丘脑、丘脑、皮层、中脑和延髓)中Tβ4、阿片肽(ENK、END和DYN)、抗阿片肽(CCK和OFQ)、μ阿片受体(MOR)和CCK B型受体(CCKBR)的mRNA和蛋白在第1、4和8天的表达谱。结果显示:各脑区的Tβ4水平在第1、4和8天增加,并与鼠尾潜伏期(TFL)变化率相关。反复电针期间,Tβ4抗体和其siRNA均延缓大鼠电针耐受的形成。Tβ4 siRNA使各脑区Tβ4水平下降,导致大多数脑区ENK、END、DYN和MOR水平增加,但不影响多数脑区OFQ、CCK-8和CCKBR水平。除延髓外,其他脑区中Tβ4水平与ENK、END、DYN或MOR水平负相关,Tβ4水平与某些脑区中OFQ或CCK-8水平正相关。这些结果表明Tβ4可能通过负向改变中枢神经系统内源性阿片肽及其受体水平,及正向影响其中抗阿片肽水平而促进电针耐受的形成。