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类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种自身免疫异常的、系统性多关节性疾病,成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes, FLS)在RA病理机制中起关键作用。Wnt信号影响RA病理机制,对RA病理发挥重要的调控作用。Masala等研究发现在脊髓发育不良的髓细胞,分泌型卷曲相关蛋白4(Secreted Frizzled-Related Protein4, SFRP4)发生表观遗传学修饰致其表达降低,诱发Wnt信号激活。在RA病理变化中,是否也存在SFRP4表达变化,Wnt信号影响RA的病理变化是否与SFRP4有关?佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis, AA)具有与RA相似的病理学、免疫学特点,是理想的RA动物模型。本实验采用AA大鼠作为RA研究动物模型,研究SFRP4在对照组大鼠和AA大鼠滑膜中的表达变化,及其对Wnt信号的影响,深入研究在AA病理中SFRP4基因发生的表观遗传学修饰,揭示甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG binding protein2, MeCP2)和DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1, DNMT1)对SFRP4表达的影响,以及microRNA(miR)-152在其中发挥的重要作用,为RA的研究与防治提供新的思路。研究内容主要包括以下五个部分：1. SFRP4在AA大鼠滑膜中的表达,及其与Wnt信号的关系。免疫组化、RT-PCR和Western blotting检测SFRP4在对照大鼠和AA大鼠滑膜组织中的表达变化,分离培养对照大鼠和AA大鼠FLS, RT-PCR和Western blotting检测SFRP4在对照大鼠和AA大鼠FLS中的表达变化。结果发现,与对照相比,SFRP4在AA大鼠滑膜组织和FLS中表达均显著降低,提示异常表达的SFRP4可能对AA病理机制发挥调控作用。为了研究SFRP4在AA大鼠中对Wnt信号的调控作用,分离培养对照大鼠滑膜FLS,培养液中加入SFRP4抗体,采用real time qPCR和Western blotting检钡SFRP4抗体对对照大鼠FLS Wnt信号通路关键基因β-catenin表达的影响,结果发现,SFRP4抗体显著上调对照大鼠FLS的β-catenin表达。为进一步验证SFRP4对Wnt信号的影响,AA大鼠FLS培养液中加入重组SFRP4蛋白,Western blotting检测发现重组SFRP4蛋白能显著抑制AA大鼠FLS的β-catenin、fibronectin表达。提示SFRP4可能通过抑制Wnt信号影响AA病理变化。2.DNA甲基化特异性抑制剂(5-aza-2’-deoxycytidine,5-azadC)对AA大鼠SFRP4表达的影响。采用RT-PCR、Western blotting、MTT等实验方法检测5-azadC刺激AA大鼠FLS对SFRP4表达的影响,结果发现2.5μM,5.0μM,7.5μM剂量的5-azadC分别刺激AA大鼠FLS均能显著上调SFRP4表达,5μM5-azadC分别刺激培养AA大鼠FLS24、48、72h后SFRP4表达均显著升高,提示AA病理中SFRP4基因可能发生了DNA甲基化修饰致其表达降低。进一步研究发现5μM5-azadC刺激AA大鼠FLS24、48、72h后均能显著抑制经典Wnt信号通路关键基因β-catenin、ccndl表达。同时5μM5-azadC刺激AA大鼠FLS24、48、72h后均能显著抑制fibronectin表达和AA大鼠FLS增殖。上述结果综合提示,AA病理中SFRP4低表达可能与SFRP4基因发生了DNA甲基化修饰有关,而5-azadC能上调SFRP4表达,进而能抑制β-catenin、ccnd1、fibronectin表达,表明SFRP4可能通过Wnt信号通路影响AA病理变化。3. MeCP2对AA大鼠SFRP4表达的影响采用RT-PCR和Western blotting检测MeCP2在对照大鼠和AA大鼠滑膜组织中的表达差异。结果发现,与对照相比,MeCP2在AA大鼠滑膜组织中表达显著升高,RT-PCR和Western blotting检测进一步发现,在AA大鼠FLS中,MeCP2表达显著高于对照。采用LipofectamineTM2000转染试剂转染siMeCP2至AA大鼠FLS,研究MeCP2表达抑制对SFRP4表达的影响。结果发现MeCP2表达抑制后,SFRP4表达显著升高。以上实验结果提示,AA病理中异常高表达的MeCP2可能与抑制SFRP4表达有关。4. DNMT1对AA大鼠SFRP4表达的影响Real time qPCR和Western blotting检测DNMT1在对照大鼠和AA大鼠滑膜组织中的表达。结果发现,与对照相比,在AA大鼠滑膜组织中DNMT1表达显著上调,real time qPCR和Western blotting检测进一步发现DNMT1在AA大鼠FLS中的表达显著高于对照,DNMT1表达抑制后SFRP4表达显著升高。以上实验结果提示,AA病理中异常高表达的DNMT1可能与SFRP4表达下调有关。5.MiR-152对AA大鼠SFRP4的作用及信号通路采用real time qPCR、Western blotting、MTT等方法检测miR-152在对照大鼠和AA大鼠中的表达差异及其对DNMT1表达的影响,进一步研究过表达的miR-152对SFRP4表达的影响,对Wnt信号的影响和对AA的抑制作用。结果发现miR-152在AA大鼠中表达显著下调,过表达的miR-152抑制DNMT1的表达,上调SFRP4的表达,抑制经典Wnt信号,抑制AA大鼠FLS异常增殖。以上实验结果提示,miR-152具有抑制AA的作用,并且这种抑制作用可能是通过对DNMT1表达的抑制和对Wnt信号的抑制实现的。综上所述,在AA大鼠中SFRP4基因可能发生表观遗传学修饰致其表达降低,进而引发Wnt信号激活,促进AA的发生发展。在AA大鼠中高表达的DNMT1和MeCP2可能抑制SFRP4表达,而低表达的miR-152可能与DNMT1的高表达相关,DNMT1, MeCP2和miR-152对AA大鼠SFRP4低表达发挥重要作用。