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目的:白血病是我国十个高发的恶性肿瘤之一,其中以急性髓系白血病最为多见。患者经治疗后,达到临床和血液学的完全缓解,体内仍有106-108个残留白血病细胞,称为微小残留病(minimal residual disease, MRD)。目前认为MRD是导致白血病复发的根源,是导致白血病患者不能长期生存的重要因素,如何提高MRD的检测技术已成为白血病治疗的一个重要课题。近年来,随着维甲酸和三氧化二砷的临床应用,急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia , APL)患者的完全缓解(complete remission, CR)率得到明显的提高,但是仍有部分患者出现复发的现象。一些前瞻性研究表明,监测MRD有助于预后的判断,完善白血病的临床分型和指导个体化治疗。实时荧光定量PCR技术可以使PCR产物积累在PCR扩增过程中进行实时监控,因而它具有特异性强,准确度和自动化程度高等特点。APL最为常见的染色体易位为t(15;17)(q22;q21),造成早幼粒细胞白血病基因(promyelocytic leukemia,PML)与维甲酸受体α基因(Retinoic acid receptorα,RARα)的重排,形成PML- RARα融合基因。本研究利用PML- RARα融合基因作为肿瘤标志,应用实时荧光定量PCR技术,检测了31例不同状态的APL患者(诊断、CR和复发),并对其中6例患者的MRD进行了动态追踪。流式细胞术通过检测在正常骨髓或外周血上不表达或低表达而在白血病细胞上表达或高表达的免疫表型来定量MRD。本研究采用了CD15/CD117/CD33/HLA-DR的抗体组合监测患者MRD,通过计算MRD%来评估患者的状态,我们同时分析了残留白血病细胞的凋亡情况,应用三个凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl,通过Bax /Bcl-2比值和抗凋亡指数(AAI)来分析其在不同状态的APL患者中的表达情况。荧光原位杂交( fluorescence in situhybridization,FISH)技术通过特定分子的荧光素标记探针和染色体进行原位杂交,可在单个细胞中显示特定DNA序列的相互位置关系,从而可直观和准确地显示融合基因,本研究利用PML-RARα融合基因作为MRD监测标志分析了部分APL患者。我们应用荧光定量PCR,流式细胞术和荧光原位杂交技术检测APL患者的MRD,藉此探讨其在MRD监测中的应用价值。方法:1.应用体外转录的方法构建目的基因PML-RARα及管家基因ABL的RNA标准品。提取人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4的总RNA,根据已知的序列设计和合成引物,用反转录PCR(RT-PCR)方法进行扩增。目的基因PML-RARα扩增片段与质粒PMD-18T连接,转化入大肠杆菌感受态细胞JM-109中,37℃过夜培养,筛选出重组体,提取、纯化质粒,对测序结果正确的质粒用HindⅢ酶切,产物进行体外转录;而管家基因ABL(Ableson gene)的扩增片段直接进行体外转录。将RNA标准品梯度稀释作为模板进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。2.利用构建成功的两个RNA标准品计算诊断、CR和复发状态患者目的基因PML-RARα的相对值,从而监测其MRD水平。3.采用CD15/CD117/CD33/HLA-DR的抗体组合,应用流式细胞术( flow cytometry, FCM)通过计算MRD%来监测患者的MRD水平。4.应用三个凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl,通过Bax /Bcl-2比值和抗凋亡指数(AAI)分析其在不同状态的APL患者中的表达情况,以达到监测MRD的目的。5.利用PML-RARα融合基因作为MRD监测标志分析部分APL患者。结果:1.构建的两个RNA标准品可以得到良好的标准曲线,且标准曲线显示线形关系良好,表明标准品构建成功。2.应用荧光定量PCR技术分析患者诊断、CR和复发状态的MRD水平,结果显示有显著性差异(P<0.05)。3.随访期患者的PML-RARα的相对值变化较大,诊断时较高,CR时下降,复发时又出现上升。如果该患者在CR时的相对值呈现上升趋势,提示该患者复发的机率大。4. MRD%>1的患者尽管仍处于临床CR期,但是提示该患者的预后并不乐观,这与定量PCR监测结果相符。5. Bax /Bcl-2比值与患者的预后呈正比例关系,即Bax /Bcl-2比值越低,患者预后越差;相反,AAI与患者的预后呈现负相关,AAI越高,患者预后越差。6. FISH检测呈现阳性的追踪患者,复发机率大。结论:荧光定量PCR技术监测白血病患者的MRD具有临床适用性,随访期的MRD定量监测及动态追踪监测具有预后价值,进而可以更好的指导临床治疗,延长患者CR期和长期存活率。荧光定量PCR技术结合流式细胞术和荧光原位杂交结果综合判断对于MRD的监测和判断预后有着重要的临床意义。