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目的探讨炎症细胞因子IL-8(interleukin-8)通过C14orf166调控Snail并促进乳腺癌上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)分子机制,解析C14orf166在乳腺癌疾病进程中的作用。方法1、将乳腺癌细胞株MCF-7/SK-BR-3分为以下四组:PBS、IL-8、IL-8+LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)及IL-8+DMSO,采用免疫印迹试验(Western blotting,WB)和半定量PCR(Semi-quantitative Real-time PCR)检测C14orf166表达情况;并在乳腺癌细胞中加入C14orf166特异性化学合成小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA),观察Snail蛋白水平是否受IL-8的调控。2、在乳腺癌细胞株MCF-7、SK-BR-3中转染C14orf166特异性si RNA或过表达质粒(p CMV-tag2B-C14orf166),采用Western blotting及实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR)观察Snail及EMT相关分子标志物E-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白水平变化,同时通过划痕试验(Scratch assay)和侵袭试验(Transwell assay)检测细胞侵袭、迁移功能变化。3、在乳腺癌细胞中过表达C14orf166,同时用翻译抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理乳腺癌细胞,通过Western blotting及灰度值扫描,检测Snail半衰期变化,确定C14orf166是否调控Snail翻译,IL-8是否能上调乳腺癌细胞磷酸化Snail(p-Snail(S246))。加入C14orf166 sh RNA慢病毒或过表达C14orf166,Western blotting观察p-Snail水平,并进一步分离核浆蛋白观察p-Snail在核浆分布变化情况。4、用C14orf166 sh RNA慢病毒感染乳腺癌细胞MCF-7,嘌呤霉素(Puromycin)筛选C14orf166稳定干扰细胞株,接种至裸鼠脂肪垫,待成瘤后于原位注射PBS或IL-8,观察肿瘤体积变化。4周后处死小鼠,取移植瘤小鼠肿瘤及肝、肺组织,通过免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法观察C14orf166、Snail、p-Snail及EMT相关分子标志物的变化。H&E染色观察肿瘤转移情况。5、收集乳腺癌及正常乳腺组织临床标本,通过IHC技术检测CXCRB、C14orf166、Snail及EMT分子标志物等表达水平,以及分析与肿瘤恶性程度和迁移转移的相关性。通过Kaplan-Meier Plotter分析,预测C14orf166表达水平与乳腺癌病人生存的相关性。结果1、Western blotting及半定量PCR结果均表明,PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可抑制IL-8对C14orf166的上调。当C14orf166被特异性干扰,IL-8则失去上调Snail的能力。2、Western blotting结果表明,在MCF-7、SK-BR-3细胞中敲减C14orf166,Snail蛋白水平明显下降,同时上皮标志物随之上升,而间质标志物随之下降,细胞侵袭迁移能力明显受到抑制;在MCF-7、SK-BR-3细胞中过表达C14orf166,Snail蛋白水平明显上升,同时EMT相关标志物也发生了相应变化,细胞侵袭迁移能力明显上升。然而,定量PCR结果表明,Snail的m RNA水平在这两种处理因素下并未受到明显影响。3、Western blotting结果表明,CHX处理细胞后,C14orf166过表达组中Snail半衰期明显延长,且p-Snail在IL-8刺激后随时间上升。当敲减C14orf166时,p-Snail蛋白水平随之下降,并在细胞核中分布减少。同时,当过表达C14orf166时,p-Snail蛋白水平也随之上升,在细胞核中聚集增多。4、IL-8能促进乳腺癌移植瘤小鼠肿瘤生长,当干扰C14orf166时,IL-8对乳腺肿瘤的促进作用明显受到抑制。IHC结果证明,IL-8可在体内促进C14orf166、Snail、p-Snail、Vimentin及Fibronectin的表达,抑制E-cadherin的表达,而C14orf166的缺失明显抑制了IL-8引起的上述变化。IL-8能促进乳腺癌转移,而C14orf166的缺失抑制了乳腺癌发生肝肺转移。5、IHC染色表明,随着乳腺组织恶性程度增加,CXCRB、C14orf166、Snail、Vimentin、Fibronectin表达明显增强,E-cadherin表达明显减弱。生存曲线表明,高水平的C14orf166与乳腺癌病人高死亡率具有明显相关性。结论1、IL-8通过PI3K/Akt通路上调C14orf166而介导Snail的表达。2、C14orf166在乳腺癌细胞中通过调控Snail而影响乳腺癌细胞EMT发生及细胞功能变化。3、C14orf166对乳腺癌细胞侵袭迁移功能的影响是通过调控p-Snail核转位发挥作用的。4、体内试验证明,干扰C14orf166可抑制乳腺癌生长及侵袭转移。5、临床标本中,C14orf166与乳腺癌恶性程度的相关基因表达具有明显相关性,且高水平的C14orf166可促进乳腺癌患者死亡率升高。