荧光显微镜因其无接触探测的优点,常被应用于生物学和化学实验室。然而,现有荧光成像方法通常存在一对无法克服的矛盾:一方面,为了实现较高的时空分辨率,我们需要借助大功率光源激发荧光探针,以便在较短时间内搜集足够的荧光信号;而另一方面,强光源带来的荧光漂白作用又限制了长时间实时成像的能力,这在受激发射损耗(STED,STimulated Emission Depletion)超分辨成像领域表现得尤其突出。因此,发展新的荧光探针,更科学的成像方法对于具有重要意义。本论文的研究工作就显微镜的多功能改造入手,对实现了STED显微镜和多模式暗场显微镜的搭建和应用做了系列研究,具体内容如下:(1)传统远场光学显微镜由于衍射极限的限制,在可见光范围内,显微镜的分辨率最高只能达到200 nm。科学家们针对这一问题,提出了多种超分辨显微技术。但是,在众多超分辨显微技术中,只有STED是在物理层面上直接获得超分辨图像,而不用经过大量的数据分析。本论文使用超连续脉冲激光和单色592 nm连续激光作为光源,完成了STED照明系统的搭建,在外接导入Leica SP5扫描荧光共聚焦显微镜后,可实现连续光激发-连续光损耗、脉冲光激发-脉冲光损耗、脉冲光激发-脉冲光损耗三大STED成像模式。此外,还利用徕卡DMI8显微镜架通过NI(National Instrument)作为信号的输入和控制,完成了STED显微镜的搭建。(2)有机半导体聚合物量子点(Pdots)由于其良好的生物兼容性和出色的荧光性能,在光学成像领域内显示出了很强的抗漂白能力以及十分高的量子产率,对STED长时间观察具有很好的应用前景。但是,Pdots由于激发光谱宽,在STED成像时会受到激发光与损耗光的双重激发,造成其在STED成像时超分辨信号受到干扰无法实现正常的STED成像。本文针对这一问题利用损耗光进行二次成像,通过科学的算法,对STED成像中损耗光激发产生的信号定量扣除,获得高保真的超分辨信号。(3)金属纳米颗粒由于其局域表面等离子共振(LSPR,Localized Surface Plasmon Resonance),能显示出独特的光吸收和散射特性,常被应用于物理、化学和生物领域的分析检测。这类探针具有高强度、高稳定性,以及可以长时间成像观察等优势。对于单个金属纳米颗粒的LSPR光谱研究通常采用暗场显微镜(DFM,Dark-Field Microscopy)与光谱仪来观察。但是,现有的暗场显微镜-光谱仪联用装置受限于自带照明光源的强度与光谱范围等原因,造成对散射信号较弱的样品光谱采集时间长、采集范围窄,例如,无法做到对粒径在30 nm以下的小颗粒纳米金进行实时观察。本文针对这一问题使用超连续激光器作为光源,使对单个金属纳米颗粒的光谱采集时间可以缩短至1 ms。此外,针对细胞功能成像的需求,增加了光片成像模式,通过切换滤块,能够实现荧光成像与暗场成像的共定位。