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目的:比较人白血病抑制因子(hLIF)的不同添加方式对脐血造血干/祖细胞体外增殖过程中自我更新和归巢潜能的影响,并研究hLIF对JAK/STAT信号通路的激活作用及其在维持造血干细胞增殖和自我更新过程中的分子机制。方法:1.将本科室构建成功并鉴定正确的重组腺病毒载体Ad-hLIF和Ad-GFP体外感染WI-38细胞(一组为重组腺病毒直接感染WI-38细胞,另一组为先将WI-38细胞接种于丝素膜上,再用腺病毒感染),经RT-PCR、ELISA法检测hLIF在饲养层细胞中的表达。2.将Ad-hLIF及Ad-GFP等感染的WI-38细胞作为脐血造血干/祖细胞体外培养的饲养层细胞(或直接添加hLIF),并以细胞因子等组作为对照,体外培养7d后,通过流式细胞仪检测法和Transwell法,比较各组干细胞体外培养后细胞表面黏附分子的表达变化,以判断细胞的分化及归巢潜能,并培养30d后观测各组细胞的扩增情况。3.在基因转染饲养层组、空载体组和细胞因子组共培养体系中中加入JAK/STAT信号通路的特异性阻断剂AG490,并设无阻断剂的对照组,共培养7d后流式细胞术检测表面黏附分子的表达量,Transwell法检测干细胞的归巢能力。4.RT-PCR法和免疫细胞化学法检测各实验组和对照组细胞中STAT3的转录和表达。5.Western blot法检测各培养体系干细胞中p-STAT3和活化的蛋白激酶p-JAK1、p-JAK2的表达变化,做28d的长期培养后进行细胞计数,绘制细胞生长曲线,并在不同时间点流式细胞术检测CD34+的比例,比较阻断前后干细胞自我更新能力的维持。结果:1.用RT-PCR、ELISA法检测到转染Ad-hLIF的WI-38饲养层细胞中有hLIF基因的转录和表达;2.造血干/祖细胞直接加在饲养层上面和饲养层细胞悬浮于干细胞培养体系中均能对造血干细胞的体外扩增和自我更新发挥重要作用,两者之间没有显著差异,直接添加hLIF的方式对干细胞体外扩增和自我更新能力的维持作用显著低于前两种添加方式;3.加入JAK/STAT信号通路的阻断剂后,干细胞表面黏附分子的表达和体外归巢能力均降低,RT-PCR法和免疫细胞化学法检测到加入阻断剂前后干细胞中STAT3的转录和表达没有明显变化;4.Western blot法检测到加入阻断剂后干细胞中STAT3和蛋白酪氨酸激酶JAK1、JAK2的活化明显受到抑制,并且加入阻断剂后干细胞增长速度明显变慢,相同时间点加入阻断剂培养的干细胞CD34+比例低于未添加组,两者间的差异有统计学意义。结论:1.干细胞直接加于饲养层细胞上或饲养层细胞悬浮于干细胞培养体系中均对造血干细胞体外扩增和维持自我更新发挥重要作用,两者间无显著差异;2.饲养层细胞分泌hLIF的添加方式明显优于直接添加细胞因子hLIF;3.饲养层分泌的hLIF可以成功激活JAK/STAT信号通路,并通过此信号通路影响造血干细胞的自我更新及归巢相关功能。