D-海因酶产生菌的筛选、性质及固定化研究

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本文以DL-对羟基苯海因(DL-p-HPH)为唯一氮源,从自然资源中进行D-海因酶产生菌株的筛选。利用双层平板法和微孔快速筛选法,共筛得三株有活力的菌株,对其中活力较好的一株进行了深入研究。对上述菌株进行培养后,加入底物进行生物转化,转化液用TLC法和HPLC法液进行了初步鉴定。结果显示转化液中在与产物对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)标样相同的Rf值处,有对应的斑点出现。后将转化产物用NANO2进行处理后进一步提纯分离,使用了732型阳离子树脂,上柱的流速为2ml/min,而后用0.2mol/L的NaOH溶液以0.4mL/min的速度进行洗脱。将洗脱得到的溶液浓缩结晶,得到纯品后运用HPLC、旋光度和红外进行了测定,确定了产物为D-p-HPG。在上述研究的基础上,对该菌种进行了16S rRNA鉴定,鉴定结果为革兰氏阴性菌,产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)。通过对该菌的培养条件进行优化,确定其最适的培养条件为:最适碳源为甘油,氮源为酵母膏,最适生长温度为28-30℃,最佳起始pH值为pH7.0,最佳装样体积为50mL/250mL的三角瓶。产酶细胞的生物量在培养了48小时时达到了最高,但酶活在培养了大约24小时时为最高。此后又对该菌进行了固定化,最终选择PVA-硼酸法,并确定0.1 g/mL的PVA浓度为固定化该细胞的最适浓度,固定化过程中,在饱和的硼酸溶液中加入0.01 g/mL的Mg2+具有较好的效果。固定化后的细胞对pH的耐受范围增大;连续反应7批,保持相对酶活80%以上;储存稳定性较好,4℃下储存一个月,相对酶活仍然在80%左右;固定化细胞的最适反应温度从固定化前的37℃上升到47-50℃,在最适温度下,相对酶活为游离细胞的3倍。采用本文的固定化方法不但提高了细胞的稳定性,同时能较大幅度地提高酶的活力,所以这种方法为以后工业化过程的研究奠定了良好的基础。
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