【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨脓毒症肺损伤过程中线粒体自噬对肺泡巨噬细胞焦亡的调控作用及可能机制。方法:1.通过生信分析预测靶向NLRP3的miRNAs并筛选得到miR-138-5p,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-138-5p与NLRP3 mRNA 3’-UTR的靶向结合。采用生信分析预测miR-138-5p启动子区域CpG岛分布情况。2.使用LPS刺激AM构建脓毒症肺损伤体外模型,AM分别予PBS
【基金项目】
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国家自然科学基金（项目编号:81871548、81560306）
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目的:本研究旨在探讨脓毒症肺损伤过程中线粒体自噬对肺泡巨噬细胞焦亡的调控作用及可能机制。方法:1.通过生信分析预测靶向NLRP3的miRNAs并筛选得到miR-138-5p,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-138-5p与NLRP3 mRNA 3’-UTR的靶向结合。采用生信分析预测miR-138-5p启动子区域CpG岛分布情况。2.使用LPS刺激AM构建脓毒症肺损伤体外模型,AM分别予PBS、LPS、LPS+sh-NC、LPS+sh-NLRP3、LPS+mimic-NC、LPS+miR-138-5p-mimic、LPS+DMSO、LPS+5-Aza、LPS+5-Aza+inhibitor-NC、LPS+5-Aza+miR-138-5p-inhibitor、LPS+CCCP或LPS+CCCP+mtDNA处理。通过电镜观察细胞膜孔形成情况;采用FAM-FLICA caspase荧光显微镜分析检测caspase活性及细胞膜通透性;使用Western Blot检测焦亡和炎症相关蛋白表达水平;通过ELISA检测细胞上清液中IL-1β和IL-18水平;采用qRT-PCR检测miR-138-5p表达水平;采用MSP和CHIP检测miR-138-5p启动子甲基化水平。3.采用CLP术构建脓毒症肺损伤体内模型,野生型小鼠分别予假手术、CLP、CLP+AgomiR-NC、CLP+AgomiR-138-5p、CLP+5-Aza、CLP+5-Aza+AntagomiR-NC、CLP+5-Aza+AntagomiR-138-5p、CLP+CCCP或CLP+CCCP+mtDNA处理;NLRP3基因敲除小鼠予假手术或CLP处理。通过HE染色观察肺损伤情况;采用免疫组化检测肺组织中焦亡和炎症相关蛋白表达水平;采用透射电镜观察线粒体自噬体及线粒体自噬溶酶体形成;使用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3B表达水平;通过qRT-PCR检测肺组织miR-138-5p表达水平;采用MSP检测肺组织miR-138-5p启动子甲基化水平。结果:1.经LPS处理的AM有细胞膜孔形成,表现出细胞焦亡和炎症损伤,转染NLRP3慢病毒可抑制LPS诱导的AM焦亡和炎症;NLRP3基因敲除可减轻CLP小鼠脓毒症肺损伤;2.双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-138-5p与NLRP3 mRNA 3’-UTR存在靶向结合,过表达miR-138-5p可通过靶向抑制NLRP3表达减轻AM焦亡和炎症,削弱脓毒症肺损伤;3.脓毒症ALI中,AM内miR-138-5p的表达以甲基化依赖的方式降低;4.DNA甲基化抑制剂5-Aza预处理可减轻体内外脓毒症肺损伤,而功能性缺失miR-138-5p能逆转5-Aza的作用,表明5-Aza通过诱导miR-138-5p启动子去甲基化来减轻肺部炎症;5.和sham组相比,CLP组肺组织可观察到线粒体自噬体,且LC3BⅡ/Ⅰ比值升高,而CCCP预处理可进一步增强线粒体自噬;此外,线粒体自噬增强可通过降低胞质mtDNA水平诱导miR-138-5p启动子去甲基化;6.通过CCCP增强线粒体自噬可抑制AM焦亡和炎症反应,减轻脓毒症肺损伤。结论:在脓毒症ALI中,线粒体自噬可通过降低胞质mtDNA水平诱导miR-138-5p启动子去甲基化,上调miR-138-5p表达,从而抑制NLRP3炎性小体活化,减轻AM焦亡和炎症反应。
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