2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是以胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足为病理生理基础的内分泌代谢性疾病。由糖尿病引起的各种急、慢性并发症严重影响患者的身心健康和生活质量。中医药防治糖尿病及其并发症有着独特的优势,北京中医药大学东直门医院内分泌重点学科在治疗糖尿病时重视清热及益气治法,取得了良好的临床疗效。本文用数据挖掘、网络药理学及动物实验相结合的方法,对清热益气法的用药规律及相关药物的作用机制进行了探索,为清热益气法治疗2型糖尿病的临床应用和科学研究提供数据支撑和科学依据。目的1通过数据挖掘方法,梳理吕仁和教授及其学术传承人赵进喜教授治疗2型糖尿病经验的学术思想和传承特点,总结清热益气治法指导的临床用药规律,发现清热益气法的核心药物配伍。2基于网络药理学分析,探索清热益气代表药对黄连、人参治疗2型糖尿病的靶点及机制,为进一步的实验研究提供思路。3基于2型糖尿病的炎症学说及肠道菌群致病学说,通过动物实验,阐明黄连、人参“药对”治疗2型糖尿病的抗炎机制。方法1通过描述性统计、关联规则、系统聚类、贝叶斯网络及支持向量机等定量研究方法,总结吕仁和、赵进喜两位医家治疗糖尿病的学术思想和经验传承特点,重点对清热益气治法方药进行研究,挖掘药物配伍及证治规律。2通过网络药理学分析方法,使用TCMSP平台筛选清热益气药对黄连、人参的化学成分,并应用STITCH、DrugBank、TTD、GAD和DisGeNET数据库,筛选药物活性成分及T2DM相关靶点。采用Cytoscape软件构建靶点蛋白网络,通过David数据库对靶点进行生物学功能及通路富集分析。3通过动物实验,选用自发性2型糖尿病db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、黄连人参组,以同窝db/m小鼠作为空白对照组。通过LAL显色法、蛋白印迹法等技术,对小鼠血糖、体重、LPS、炎症因子、NF-κB p65、p-NF-K B p65、TLR4等指标进行检测。同时采用16srDNA技术分析小鼠肠道菌群。最终,从调节肠道菌群的角度,明确黄连、人参药对抗炎、改善胰岛素抵抗的机制。结果1①本研究共纳入有效病例692例,包括吕仁和诊疗病例323例,赵进喜诊疗病例369例。其中有男性354例,女性338例。在纳入的病案中,出现最多的证候为内热证、阴虚证、气虚证和血瘀证。排名前10位的为口干、乏力、眠差、口苦、麻木、大便干、头晕、视物模糊、性急易怒,口干、乏力是糖尿病患者中出现次数最高的症状,体现了消渴病“热伤气阴”的病机特点。2糖尿病患者中,以口苦(1.657),性急易怒(1.599),耳鸣(1.185),烦热(1.061),苔干(0.972),胸胁满闷(0.761),舌边浊沫(0.735)为特点的郁热证最为多见。SMO分析发现舌下络瘀在结热证中具有较高的权重,善太息在气虚证具有较高权重,健忘、舌质紫暗在湿热证具有较高权重,胃痛、瘀斑舌、口臭在郁热证具有较高的权重,可能为相关症状的辨证和治疗提供了一定的思路。在两位医家的医案中,均应用了较多的寒性药物,其次为温性及平性药。②根据关联规则及聚类分析,在吕仁和医案及赵进喜医案中,发现香橼、佛手,乌药、香附,桃仁、红花,葛根、丹参,赤芍,白芍等治疗糖尿病常用药对,并在关联规则分析中,发现唯一具有关联关系清热益气药对黄连、入参(置信度0.912)。③通过朴素贝叶斯分析,可以得到不同药物在不同证候中应用概率,如半夏(0.775)、黄连(0.704)、葛根(0.769)、茯苓(0.577)、知母(0.352)、瓜蒌(0.31)多应用在痰热证中;生地黄(0.462)、玄参(0.385)、北沙参(0.359)、天花粉(0.179)、熟大黄(0.179)、当归(0.179)、丹皮(0.128)多应用在结热证中;黄芩(0.877)、白芍(0.79)、赤芍(0.525)、柴胡(0.796)、陈皮(0.673)多应用在郁热证中;白术(0.447)、苍术(0.319)、黄柏(0.213)、川牛膝(0.128)、牛膝(0.149)多应用在湿热证中。④通过贝叶斯及SMO分析,又进一步发现了症-药、证-药、证-症之间的内在关联。得到证-症-药的联系。如吕仁和医案中阴虚-手足心热(2.149)-栀子(0.571),阴虚-盗汗(1.77)-丹皮(0.688),郁热证-烦热(1.061)丹皮(0.667),赵进喜医案中郁热证-口苦(1.657)-黄芩(0.887),郁热-耳鸣(1.185)-黄芩(0.886),阴虚-盗汗(1.77)-生地黄(0.522),阴虚-手足心热(2.149)-地骨皮(0.846)等。2通过网络药理学分析,将数据挖掘分析得到的清热益气药对黄连、人参的活性成分和靶点进行筛选,得到人参靶点144个,黄连靶点246个,2型糖尿病相关靶点350个。匹配得到42个黄连、人参“药对”治疗T2DM潜在靶点。黄连、人参“药对”的主要活性成分中,槲皮素、小檗碱、山奈酚、花生四烯酸、阿魏酸、豆甾醇等拥有较多的预测靶点,这些化合物可能是黄连、人参“药对”中产生药理作用的重要化合物。黄连、人参药对治疗2型糖尿病的核心靶点和药物代谢、胰岛素抵抗、炎症反应相关,并且参与了AMPK信号通路、NF-κB信号通路、TNF信号通路以及胰高血糖素信号通路,其中核心靶点TNF、IL1B是NF-κB信号通路和TNF信号通路的共同靶点。由此我们推测,黄连、人参药对是通过调节肠道菌群,纠正因菌群紊乱导致的LPS/NF-κB/炎症通路激活起到抗炎作用。3①通过对小鼠的一般状况观察发现,非糖尿病db/m小鼠毛色光亮,行动敏捷,体型瘦长,活动敏捷,对外界的刺激反应大。而2型糖尿病db/db小鼠形体肥胖,动作迟缓,活动少,摄食及饮水增多,对外界刺激反应明显迟钝。在灌胃的后期,模型组又出现竖毛,体温偏低的表现,且模型组个别小鼠在最后一周出现了体重骤降。而其他组小鼠体重基本平稳的上升。②经过8周黄连人参中药的灌胃干预后,小鼠血糖出现了显著的降低。黄连、人参药对可以显著的降低2型糖尿病小鼠胰腺IL1β的表达,并抑制糖尿病小鼠肝脏NF-κ B p65的磷酸化。③在本次研究中发现,空白对照组和模型组小鼠肠道微生物共有OTU数目为543个,占两组总数的71%,说明糖尿病小鼠的肠道菌群组成和非糖尿病小鼠具有较大的差异,非糖尿病小鼠的肠道微生物丰富度及多样性均显著的小于糖尿病小鼠,这与部分既往实验结果是不一致的,而中药干预同样显著的降低了糖尿病小鼠的肠道微生物丰富度及多样性。④黄连人参组的Verrucomicrobiae(科)Bacteroides(属)、Akkermansia(属)、Lachnoclostridium(属)、Akkermansia_muciniphila(种)相对丰度显著高于模型组。而这些菌群的相对丰度和血糖值呈显著负相关,可能是黄连、人参药对调节的重要菌群。其中Akkermansia_muciniphila在减少炎症反应方面发挥着关键作用,因此可能是黄连、人参药对调节肠道菌群以降低血糖的关键菌种。结论1、糖尿病的清热益气法是基于对糖尿病“内热伤阴耗气”病机的认识发展而来,黄连、人参不仅分别是清热药和益气药的代表药物,也是治疗2型糖尿病的常用药对,在临床病案挖掘中发现其存在明显的关联关系,因此可以作为清热益气治法的代表药对进行研究。2.通过网络药理学分析发现,黄连、人参“药对”的主要活性成分中,槲皮素、小檗碱、山奈酚、花生四烯酸、阿魏酸、豆甾醇等拥有较多的预测靶点,可能是黄连、人参“药对”中产生药理作用的重要化合物。黄连、人参药对治疗2型糖尿病的核心靶点和药物代谢、胰岛素抵抗、炎症反应相关,并且参与了 AMPK信号通路、NF-κB信号通路以及胰高血糖素信号通路。其中炎症因子相关靶点TNF、IL1B等富集在NF-κB信号通路上。3.通过动物实验发现,黄连、人参药对可以显著降低2型糖尿病db/db小鼠血糖,降低小鼠血清中LPS的含量,并抑制胰腺炎症因子IL1β的表达及肝脏NF-κB p65的磷酸化。其治疗2型糖尿病的抗炎机制可能与调节肠道菌群紊乱、抑制LPS增多导致的NF-κB炎症因子通路激活有关。黄连、人参药对可以增加2型糖尿病小鼠肠道Verrucomicrobiae(科)、Bacteroides(属)、Akkermansia(属)、Lachnoclostridium(属)、Akkermansia.muciniphila(种)的相对丰度,这些菌群均和糖尿病小鼠血糖值呈显著负相关,可能是黄连、人参药对调节的重要菌群。其中Akkermansia_muciniphila在减少炎症反应方面发挥着关键作用,因此可能是黄连、人参药对调节肠道菌群以降低血糖的关键菌种。