【摘 要】
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本课题采用体外生物化学法和细胞法探讨五种中草药白蔹、白术、虎杖、甘草、刺蒺藜提取物抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素合成及清除活性氧能力,采用两种动物眼刺激替代实验（RBC溶血实验、HET-CAM实验）分别探讨五种中草药（白蔹、白术、虎杖、甘草、刺蒺藜）提取物的血红蛋白溶血率及终点评分（ES）。从美白发生机制上研究其生物活性,为新型美白化妆品的开发提供重要的理论研究依据和应用指导。具体实验方法与结果如下
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本课题采用体外生物化学法和细胞法探讨五种中草药白蔹、白术、虎杖、甘草、刺蒺藜提取物抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素合成及清除活性氧能力,采用两种动物眼刺激替代实验（RBC溶血实验、HET-CAM实验）分别探讨五种中草药（白蔹、白术、虎杖、甘草、刺蒺藜）提取物的血红蛋白溶血率及终点评分（ES）。从美白发生机制上研究其生物活性,为新型美白化妆品的开发提供重要的理论研究依据和应用指导。具体实验方法与结果如下:（1）五种中草药提取物的成分及生物安全性分析。通过红外吸收光谱、UV光谱分析,推测出五种中草药中主要含有黄酮和多酚类化合物。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法和福林酚法对五种中草药提取物和总黄酮总多酚含量进行测定,结果表明五种中草药提取物总黄酮总多酚含量存在显著性差异,甘草最多,虎杖次之。采用大型哺乳动物绵羊血细胞进行RBC实验,表明五种中草药提取物（1 mg/m L）溶血率均低于5%,几乎没有造成血红细胞损伤,即均无刺激性;采用HET-CAM实验可以看出五种中草药提取物作用下的鸡胚尿囊膜表面血管丰富,ES评分均为0分,即为无刺激性。以上结果表明五种草药是生物相容性和安全的化妆品原料。（2）通过生物酶法探究五种中草药提取物对酪氨酸酶活性的抑制效果及量效关系。五种中草药提取物对蘑菇酪氨酸酶的半数抑制浓度IC50大小顺序为甘草（0.1787 mg/m L）＞虎杖（0.2095 mg/m L）＞白术（0.2608 mg/m L）＞刺蒺藜（0.2984 mg/m L）＞曲酸（0.3212mg/m L）＞白蔹（0.4316 mg/m L）。采用细胞实验法发现,五种中草药提取物对细胞内酪氨酸酶均呈现不同程度的抑制活性,其中虎杖提取物作用下的酪氨酸酶活性在五个浓度范围下均低于阳性对照曲酸,当浓度达到1000μg/m L时,酪氨酸酶活性最低为20%。（3）通过小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10）构建细胞美白模型,分别研究五种中草药提取物对细胞内酪氨酸酶及黑色素生成含量的抑制作用及量效关系。采用细胞法表明,在五种中草药提取物中只有虎杖呈现出对细胞内黑色素良好的抑制效果。虎杖提取物在细胞安全浓度范围内黑素含量均低于25%,当浓度达到1 mg/m L时,细胞内黑素含量最低,仅为13%。以上结果表明虎杖提取物在安全的细胞浓度范围下,通过抑制酪氨酸酶的活性从而减少黑色素的生成,是潜在的美白功效活性物。（4）通过活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除化学模型探究五种中草药提取物对超氧阴离子自由基（O2·-）、羟基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+·自由基的清除效果及量效关系。五种中草药提取物对ROS均呈现较好的清除活性,并呈现显著的量效关系。其中甘草提取物在浓度为1.2 mg/m L时,对·OH的清除效率达到最高的67%,IC50为0.8 mg/m L。经大生化实验及细胞生物学实验,筛选出虎杖提取物是良好酪氨酸酶和黑色素生成抑制剂,且具有良好的抗氧化性,是潜在的美白祛斑功效活性物,为新型美白祛斑类化妆品开发提供研究方案和指导方向。
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