目的肿瘤尤其是恶性肿瘤的发病机制一直是肿瘤研究中的重点,肿瘤“免疫逃逸”机制则是研究中的重中之重。尽管我们并不清楚确切的肿瘤“免疫逃逸”机制,但是普遍认为调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)与之关系密切。中医药在临床治疗肿瘤的应用中一直有着鲜明的特色和优势,“扶正祛邪”的治疗思想在提高患者生存质量方面明显优于“好坏通杀”的传统放化疗的治疗方式。大黄是中医临床应用较广泛的一种中药,大黄素是其最重要的有效成分,有抗感染、消炎、抗肿瘤等多种免疫药理作用,但是其作用机理在不同疾病不尽相同。不难发现,大黄素治疗的这些疾病都有一个共性：存在炎症,在炎症局部出现特异性免疫细胞的聚集。提示我们,大黄素的治疗策略可能是抗炎。我们推测其抗炎的途径是抑制免疫细胞向局部聚集。例如Tregs在局部失衡的恶性肿瘤,大黄素可能抑制Tregs向肿瘤局部的迁徙。现有研究发现,大黄素具有改变Tregs在局部比例的药理作用,但是其机制阐释不清。本研究以CT26. WT(简称CT26)结肠癌细胞系为研究对象,体内体外观察CT26细胞对CD4+CD25+Tregs迁徙、趋化因子CCL17和CCL22分泌、趋化因子受体CCR4表达的影响,以及大黄素对CT26结肠癌细胞诱导的CD4+CD25+Tregs迁徙的干预作用和机制。研究方法和结果1.体外实验研究大黄素对CT26结肠癌细胞的抑制作用我们从以下三个方面,观察不同浓度的大黄素对小鼠结肠癌细胞系CT26的抑制作用。①划痕实验检测大黄素对CT26细胞迁移的影响,②Annexin V/PI试剂盒检测大黄素对CT26细胞凋亡的影响,③流式细胞术检测CT26细胞Foxp3表达,④统计学方法分析结果。研究结果显示大黄素显著抑制CT26结肠癌细胞的迁移,促进CT26细胞的凋亡,下调Foxp3在CT26细胞的表达,且这种抑制作用随浓度增加而加强。提示大黄素在体外高浓度条件下以促进结肠癌细胞CT26凋亡为主并抑制肿瘤细胞迁移,同时下调Foxp3在CT26细胞的表达,有影响调节性T细胞的可能。2.体内实验观察大黄素的免疫药理作用我们主要从三个方面观察大黄素对CT26结肠癌小鼠体内的免疫药理作用：2.1观察大黄素抑制结肠癌的作用通过建立小鼠CT26结肠癌实体瘤模型,进一步研究大黄素在体内的抑瘤效果。①建立小鼠结肠癌实体瘤模型：每只小鼠右前肢腋下接种2×106个CT26细胞,阴性对照组接种无菌生理盐水;②动物分组及给药：动物分为四组,阴性对照组、荷瘤模型组、大黄素治疗组和FTY720治疗组,依次每天给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液、大黄素(100mg/kg)、FTY720(3mg/kg)和0.5%羧甲基纤维素钠溶液,每天一次灌胃给药,连续14d,末次给药后第2天颈椎脱臼处死小鼠：③计算抑瘤率。研究结果显示建立小鼠结肠癌实体瘤模型成功率超过98%。荷瘤模型组肿瘤重量为(1.01±0.14)g,大黄素治疗组肿瘤重量为(0.26±0.08)g,FTY720治疗组肿瘤大小为(0.34±0.11)g,大黄素治疗组的抑瘤率为74%,FTY720治疗组的抑瘤率为66%,均超过30%,说明大黄素在小鼠模型中具有抑制实体瘤生长的作用(p<0.05)。2.2观察大黄素对CT26结肠癌模型小鼠CD4+CD25+Tregs迁徙的影响①流式细胞术检测不同组别外周血、(肿瘤引流或相同位置)淋巴结及肿瘤局部CD4+CD25+Tregs的比例,②流式细胞术检测CCR4在Tregs的表达,③共聚焦荧光显微镜检测肿瘤组织中趋化因子CCL17和CCL22的表达。研究结果显示：①荷瘤模型组在外周血和淋巴结中的CD4+CD25+Tregs比例与阴性对照组存在显著差异,提示大黄素改变CD4+CD25+Tregs的迁移模式;大黄素治疗组和FTY720治疗组外周血、淋巴结尤其是肿瘤局部CD4+CD25+Tregs比例显著低于荷瘤模型组,提示大黄素和FTY720有减轻肿瘤局部免疫抑制的潜力。②大黄素和FTY720可以显著减少肿瘤局部CCR4-Tregs比例；③大黄素和FTY720显著减少肿瘤组织CCL17的表达。提示大黄素通过下调CCL17/CCR4的趋化作用影响CD4-CD25-Tregs的迁移。2.3大黄素对结肠癌小鼠Tregs功能的影响①流式细胞术检测小鼠不同组织效应细胞CD8+CD3+田胞的比例,②ELISA检测小鼠血清细胞因子IFN-γ、TNT-β1、IL-10的水平,③流式细胞术检测小鼠不同组织T细胞的IFN-γ的分泌,④流式细胞术检测小鼠不同组织CD4+CD25+Tregs IL-10的分泌,⑤统计学方法分析结果。研究结果显示：①大黄素和FTY720明显降低效应细胞CD8+CD3细胞在外周血和淋巴结中的比例,却升高其在肿瘤局部的比例；提示大黄素治疗后肿瘤局部免疫抑制状态有减轻。②荷瘤模型组血清中IFN-γ、TNF-β1、IL-10的水平均显著高于阴性对照组,大黄素和FTY720可以降低此3种细胞因子在血清中的水平；移植性肿瘤在早期会出现IFN-γ的升高,大黄素本身具有消炎作用。TNF-β1、IL-10是抑制性的细胞因子,大黄素降低这两种因子的水平,有利于抗肿瘤免疫。③大黄素显著提高外周血和淋巴结中T细胞分泌的IFN-γ的能力：④大黄素和FTY720同样具有抑制CD4+CD25+Tregs分泌IL-10的作用,不同的是大黄素的抑制作用更为明显。提示大黄素不仅影响肿瘤局部的CD4+CD25+Tregs的数量,也影响CD4+CD25+Tregs的免疫抑制功能。3.探讨大黄素影响CD4+CD25+Tregs迁徙的机制通过建立小鼠结肠癌细胞CT26和脾淋巴细胞混合培养体系来观察大黄素的干预作用,探讨可能涉及的机制。主要包括以下几个部分：1.流式细胞术检测共培养体系中大黄素对CT26细胞表达Foxp3的影响；2.流式细胞术检测CD4+CD25+Tregs的比例和CCR4在CD4+CD25+Tregs表面的表达,RT-PCR检测CCR4mRNA在CD4+CD25+Tregs的表达；3.检测大黄素对CT26细胞NF-K B活化的影响。研究结果发现：1.大黄素对共培养体系中的CT26细胞表达Foxp3下调作用更明显；2.大黄素显著降低共培养体系中CD4+CD25+Treg细胞的比例,并下调CCR4在CD4+CD25+Tregs表而的表达,减少CCR4在CD4+CD25+Treg细胞的mRNA表达量;3.大黄素显著抑制CT26细胞NF-k B的活化。结论大黄素体内体外均抑制CT26结肠癌的生长;CT26结肠癌可以导致CD4+CD25+Tregs在外周淋巴器官中比例的改变和肿瘤局部的富集,而大黄素和FTY720可以减少CD4+CD25+Tregs在肿瘤局部的富集,这种减少主要和CCL17/CCR4的表达下调相关；接种CT26肿瘤可以诱导IFN-γ、TNF-β1、IL-10的水平升高,IFN-γ的升高和肿瘤抗原大量进入有关,大黄素发挥类似抗炎的作用；大黄素抑制TNF-β1、IL-10的水平,可能和抑制CD4+CD25+Tregs在局部的聚集相关；大黄素对CD4+CD25+Tregs迁徙的影响包括两个方而：一是通过抑制CT26细胞NF-k B活化,减少趋化因子CCL17的表达,改变CCL17/CCR4途径的化学趋化作用,影响CD4+CD25+Tregs迁徙；二是通过下调CT26细胞Foxp3的表达,影响CD4+CD25+Tregs的分化和增殖，控制迁徙的细胞数量,影响CD4+CD25+Tregs迁徙。大黄素抑制了Tregs迁徙,减少了CD4+CD25+Tregs在肿瘤局部的聚集,降低抑制性细胞因子的水平,减轻肿瘤局部的免疫抑制状态,进而影响结肠癌的发生发展。本研究的意义在于：1.揭示了肿瘤个体外周、肿瘤局部CD4+CD25+Tregs迁徙与CCL17/CCR4之间的相关性；2.发现大黄素抑制CT26结肠癌与CD4+CD25+Tregs迁徙之间的关系,探讨了大黄素抗癌的免疫药理作用及可能涉及的机制。为全面理解大黄素抗癌作用提供了实验依据,并为以CD4+CD25+Tregs为靶细胞的免疫调节类中药及有效成分的免疫药理研究提供了新的思路。