一、hprg1b基因的功能研究及其干细胞系建立脊椎动物hprg1基因是酵母GID2基因的同源物,它编码两种同源的蛋白异构体,分别是Hprg1a和Hprg1b。在酵母中,GID2蛋白作为一种E3泛素连接酶组分而参与调控糖代谢过程。早前在人类基因组范围内大规模筛选E3泛素连接酶的研究中,发现人的Hprg1b蛋白可通过其R型锌指结构域与E2泛素结合酶相互作用,形成一种新的泛素酶蛋白复合体。最近,Hprg1蛋白在爪蟾中的研究表明,蛙的Hprg1可能通过其E3泛素连接酶的作用而调控胚胎的头部发育。另外,含有hprg1b基因的染色体片段缺失的人类胚胎,出现严重的畸形发育。但是,目前hprg1b基因在胚胎发育中的具体作用仍不清楚。斑马鱼基因组只编码一种Hprg1蛋白,即Hprg1b蛋白。本文将斑马鱼Hprg1b的蛋白质序列,同人、小鼠、龟、鸡和爪蟾的Hprg1a和Hprg1b的蛋白质序列进行多蛋白序列比对分析,发现斑马鱼Hprg1b的蛋白质序列与这些物种中的Hprg1蛋白质序列相似度超过了68%。而且,本文分析了人、小鼠、龟、鸡、爪蟾和斑马鱼的hprg1a和hprg1b的基因结构,发现这些基因间具有非常保守的剪切位点和基因结构。在进化过程中,hprg1基因高度保守的蛋白序列和基因结构,说明了该基因的功能是高度保守的。另外,我们进一步研究了人、小鼠和斑马鱼hprg1b基因及其附近基因的染色体同线性关系,发现hprg1b基因及其附近基因在人、小鼠和斑马鱼中具有染色体同线性,说明了斑马鱼hprg1b基因是人和小鼠hprg1b基因的直系同源基因。因此,本文在斑马鱼中研究hprg1b基因的作用,有利于揭示该基因在高等脊椎动物中的作用。通过ddPCR技术,精确定量了hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达。实验结果显示,在斑马鱼的胚胎发育过程中,hprg1b基因具有很强的母源性表达,并且在斑马鱼胚胎发育的整个过程中,hprg1b基因一直持续高表达。同时,本文利用原位杂交技术分析了hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达谱,发现在斑马鱼的胚胎发育中,hprg1b基因表达的区域与斑马鱼脑部和心脏的形态建成区域完全重合。hprg1b基因在斑马鱼胚胎中的表达模式,提示hprg1b基因可能影响斑马鱼的胚胎发育,特别是脑和心脏的发育。为了研究hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育中的作用,我们设计了斑马鱼hprg1b基因的翻译阻断型morpholino。并且通过蛋白质印迹实验,发现注射该morpholino的斑马鱼,Hprg1b蛋白的表达量明显减少。在合子期阻断斑马鱼hprg1b基因的表达后,发现斑马鱼出现大量死亡,致死率高达80%。并且存活下来的斑马鱼大部分出现脑部和心脏发育异常等畸形,畸形率高达93%。在观察hprg1b基因敲低斑马鱼的脑部发育中,发现在24hpf时,hprg1b基因敲低斑马鱼的前脑区域极度变小;中脑、后脑原基和后脑区域的结构不明显。hprg1b基因敲低斑马鱼发育到72hpf时,与对照组斑马鱼相比,其头部畸形愈加明显,整个头部区域变小,无明显的前脑、中脑和后脑的形态构造。同时,仔细分析hprg1b基因敲低斑马鱼的心脏在胚胎发育过程中出现的畸形,发现其心脏畸形主要表现为心脏环化异常、心房和心室腔室变少。而且,统计72hpf的斑马鱼离体心脏的细胞数量发现与对照组斑马鱼比较,hprg1b基因敲低斑马鱼的心脏细胞明显减少。并且,通过原位杂交技术和ddPCR技术分析了早期心肌细胞分化标志基因cmlc2在心盘、心管、心房和心室等结构中的表达。与对照组斑马鱼相比,hprg1b基因敲低斑马鱼的cmlc2表达量和表达区域明显变小,说明了hprg1b基因可以通过调控心肌细胞的发育,来影响斑马鱼胚胎的心脏发育。其次,也通过原位杂交技术检测了房室通道结构发育重要调控因子bmp4在72hpf斑马鱼心房和心室交接处中的表达。实验结果显示,hprg1b基因敲低斑马鱼的bmp4的表达量明显低于正常水平,说明了hprg1b基因可能影响斑马鱼房室通道内部结构的发育。同样,在72hpf hprg1b基因敲低斑马鱼心脏中,心内膜标记因子has2表达下调,说明hprg1b基因敲低斑马鱼房室心内膜发育异常。另外,本文通过免疫组化分析发现了心肌肌球蛋白重链在hprg1b基因敲低斑马鱼的心肌细胞中表达降低,而且其排列异常,提示hprg1b基因可能影响斑马鱼心脏收缩功能。针对hprg1b基因敲低斑马鱼出现大规模死亡和畸形的现象,本文通过ddPCR技术,检测了斑马鱼胚胎发育重要的调控因子的表达。实验结果表明,hprg1b基因敲低斑马鱼的外胚层标记因子(fgf8和otx2),中胚层标记因子(gata4,gata5,和ntl),和内胚层标记因子(sox17)等基因的表达量明显低于与野生型斑马鱼,提示hprg1b基因可能通过调控斑马鱼胚胎基因的表达,来影响斑马鱼的胚胎发育。另外,本文构建了hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞系。该胚胎干细胞系具有繁殖快、转录效率高、表达多种核心多能基因的特点。随后,将hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞系移植进入了野生型斑马鱼中,追踪了Hprg1b阳性细胞的发育命运。在嵌合体斑马鱼发育到24hpf时,观察到在前脑、中脑、后脑原基、后脑和心管中,具有外源性的hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞出现。在48hpf嵌合体斑马鱼中,我们发现脑部、心室和心房中也均有外源性的hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞。hpr1gb-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞系的细胞移植实验,说明在斑马鱼的胚胎发育过程中Hprg1b阳性细胞可以发育成为脑部和心脏细胞。因此,本文利用斑马鱼模型研究hprg1b基因的功能,首次证明了hprg1b基因在脑部和心脏的发育中起作用;并建立了hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞系,为hprg1b基因的深入研究和揭示早期心脏发育的分子机制提供了很好的细胞模型。二、斑马鱼磁力蛋白和隐花色素同源基因鉴定许多动物可以通过磁场来进行定位或导航。最近在果蝇中研究发现,磁受体蛋白(MagR)和隐花色素(Cry)形成的复合体是磁力感应的分子基础。MagR和Cry蛋白广泛表达于各种动物中,但是,它们在不同动物中的功能是否保守仍不清楚。为了探究MagR和Cry在低等脊椎动物中的功能,我们分别鉴定并分析了它们在斑马鱼中对应的同源基因的表达情况。人基因组含有一个MAGR基因和2个CRY基因。斑马鱼也只有一个magr基因,却含有7个cry基因。通过蛋白序列比对、基因结构和染色体同线性分析,我们发现magr基因在进化过程中高度保守,并且斑马鱼magr基因是人MAGR基因的直系同源基因。并且,斑马鱼有4个cry1基因(cry1aa,cry1ab,cry1ba,cry1bb)是人类CRY1基因的同源基因,1个人CRY2直系同源的基因,以及2个斑马鱼cry相似基因(cry4和cry5)。RT-PCR分析发现,在斑马鱼胚胎和成体组织中magr基因泛表达,而所有cry基因只在脑和眼睛中显著表达;在斑马鱼胚胎发育中斑马鱼magr基因和除了cry1aa外的其余cry基因都具有母源性表达。此外,我们利用翻译阻断型morphoino敲低magr基因的表达,斑马鱼没有出现明显的死亡变化和发育异常,并且胚胎发育调控因子fgf8、otx2、gata4、gata5、has2、ntl和sall4的表达也无明显变化。因此,我们的结果表明,在斑马鱼基因组中magr基因和cry2基因为单拷贝基因,cry1为多拷贝基因。而magr基因在斑马鱼器官形成中未见明显作用,提示可能需要建立magr敲除品系以进一步探究其功能。三、tmp3基因敲除斑马鱼RNAseq分析最近几年,二代测序技术迅猛发展,极大的缩减了测序费用和测序时间,使基因组转录本测序(RNAseq)分析成为研究信号通路和靶基因筛选的最佳选择。本文将tmp3基因敲除斑马鱼囊胚期的胚胎进行了转录本测序。利用tophat软件将测序序列比对到斑马鱼参考基因组上,再通过htseq-count软件分析映射结果来鉴别外显子之间的剪接点,共得到了24102个基因的表达数据。在R语言中通过DESeq2软件包,得到了tmp3基因敲除斑马鱼和野生型斑马鱼差异表达的2194个基因,其中表达上调基因为1231个,表达下调基因为963个。然后,使用goseq软件包对差异表达基因进行了基因本体(GO)富集分析。对表达下调基因的GO富集类型分析后,我们发现下调基因的GO富集类型主要与斑马鱼中胚层发育和细胞增殖相关。结合tmp3基因敲除斑马鱼心脏异常的表型,我们从表达下调的基因中挑选出与中胚层发育相关的基因dnarma、foxa2、lefty1、klf2a、mespaa、noto、tll1、apela、tbx16和tdgf1,以及与细胞增殖相关的基因rrm2、gmnn、pold1、map2k2b、ccnk、ccnl1b、cdca8、aurka和cdk4,作为tmp3的候选靶基因。总之,本文关于tmp3基因敲除斑马鱼RNAseq分析,为tmp3基因的深入研究提供了思路。