研究背景食管癌是人类最常见的癌症之一,为全球第六位,死亡率很高。据WHO的最新统计80%食管癌发生在发展中国家,中国是食管癌发生病例最多的国家,也是世界上食管癌高死亡率的国家之一。中国每年死于食管癌的患者约有15万。食管癌组织学分型主要有2个：食管鳞状细胞癌(鳞癌)和食管腺癌。食管腺癌常见于欧美国家,而我国食管癌的发病以食管鳞癌为主,约占90%。食管癌有高度转移和袭性特点,其早期发现较为不易,被确诊时多为中晚期,所以食管癌术后死亡率高,5年存活率只有15%-25%。解决食管癌中晚期生存率低的一个重要途径就是能够早期发现,早期诊断,早期治疗。目前临床上食管癌的主要诊断方法分为以下5种：1.纤维内窥镜检查。2.食管内镜超声检查。3.食管脱落细胞学检查。4.X射线钡餐造影。5.胸部CT扫描。这些方法均不能有效地早期发现食管癌的发生。早期诊断是患者存活的关键,食管癌标记性miRNA基因或信号的检测,对于假阳性及不必要的检查与治疗都有重要的意义。因而,若能进一步阐明食管癌发生发展的分子机制,提高食管癌的早期诊断,则有望提高食管癌的治愈率,降低死亡率。微小RNA (miRNA)调控是当前生命科学的重要前沿。在高等生物中,miRNA在细胞代谢、分化、信号传导、凋亡以及免疫应答等几乎全部的重要生命活动中起到关键性作用。而且已有研究表明,miRNA在癌症的发生、发展、转移、侵袭及血管生成等各方面起着非常重要的调控作用。因此将两方面的研究结合在一起,研究与食管癌的发生有关的miRNA及其功能,将有助于对食管癌发生机制的理解,也会促进食管癌诊断技术的发展,从而加速这一技术在临床诊断和生物医学领域的应用。MicroRNA (miRNA)是一类含有18-25个核苷酸的非编码的小分子RNA。它通过与其靶mRNA分子非编码区3’-UTR或其它部位互补结合,特异性抑制或增强基因表达,从而参与调控细胞的生长、发育和分化等许多复杂的生命过程。miRNAs在生物学和病理过程包括细胞分化和增殖中起重要作用,影响细胞凋亡和代谢。miRNA可以作为促癌基因或抑癌基因。有研究发现越来越多的miRNA与肿瘤发生、发展、增殖、凋亡及转移有密切关联,至少不下于数百中,其中很多miRNA被发现和食管癌的发生发展有关,但是这些miRNA与基因表达的调控方式及调节机制尚且不太清楚。miR-155是一个典型的多功能的miRNA。越来越多的实验结果证明miR-155在细胞代谢、分化、信号传导、凋亡以及免疫应答等多种生物学过程中起到重要性作用。miR-155是位于人类的21号染色体的非编码RNA,它的表达水平受BIC转录水平及miRNA加工等的调控。其中不含开放读码框的BIC,表达上调能够促进细胞的异常增殖。还有研究表明,miR-155结合MX 11等基因,通过增强myc的基因活性,从而可以促进细胞的增殖。有研究发现miR-155和BIC的表达水平在血液肿瘤的发生发展中为上调状态,如弥漫大B淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。大量实验结果表明了miR-155在众多的肿瘤疾病中表达水平上调,而且其在肿瘤发生、发展过程中起到了重要性的作用,并且它的作用主要是起到促癌的作用。据报道,miR-155-5p在乳腺癌、大肠癌、肺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤组织中表达上调,并与肿瘤的发生、发展及预后的关系密切相连。近期刘辉等发现miR-155-5p在食管鳞癌组织中高表达,但尚不明确其在食管鳞癌发生发展中的作用及具体分子机制。本研究采用qPCR检测miR-155-5p在食管鳞癌组织中的表达情况,并利用miR-155-5p类似物和抑制剂上调和下调食管鳞癌细胞Ecal09中miR-155-5p的表达,研究其在食管鳞细胞增殖、凋亡和迁移中的作用。研究方法1、标本收集收集2014年12月到2015年6月在上海奉贤区中心医院和上海仁济医院胸外科手术切除的20例食管鳞癌组织及其邻近食管正常组织距病变部位5 cm以上标本。患者年龄为43-74岁,平均年龄为58岁。所有患者术前均未进行任何化疗、放疗,且术前检查均未发现淋巴结转移及远处转移。患者行食管癌根治术后,从手术切除的食管癌组织中留取肿瘤标本(避免取肿瘤坏死区),同时在距肿瘤边缘5 cm处留取正常食管组织作为癌旁组织,所有标本均在液氮罐中冻存。20例食管鳞癌标本最终病理诊断均为食管鳞癌(ESCC)。2、细胞培养人食管鳞癌Eca109细胞购自中科院细胞库,用含10%小牛血清及1%双抗的RPMI1640培养基,在37℃,5%C02培养箱中培养。待细胞融合度达到70-80%,用0.25%胰酶37℃消化10分钟,进行细胞传代或分组实验。3、实时荧光定量qPCR检测组织miR-155-5p的表达水平提取细胞总RNA,检测RNA质量和浓度。采用特异性U6内参反转录引物及miR-155-5p反转录引物及参照miRNA cDNA Synthesis kit试剂盒说明书进行反转录。采用qPCR检测miR-155-5p的表达情况。4、细胞转染miR-155-5p类似物mimic、抑制剂inhibitor及阴性对照(mimic-NC、 inhibitor-NC)由广州锐博生物科技有限公司设计合成,转染试剂LipofectamineTM 2000购自于美国Invitrogen公司。我们将人食管鳞癌Eca109细胞分为五组,分别如下:miR-55-5p mimic类似物(Lipofectamine2000+miR-55-5p mimic); NC(mimic)阴性对照组(Lipofectamine2000+NC(mimic)); miR-55-5p inhibitor抑制物组(Lipofectamine2000+miR-55-5p inhibitor); NC(inhibitor)阴性对照组(Lipofectamine2000+NC(inhibitor));未转染空白对照组Blank组(仅加同等量Lipofectamine2000旨质体)。转染前在6孔板中种植人食管鳞癌Eca109细胞,待细胞达到70-80%融合时按转染说明书进行操作。5、实时荧光定量qPCR法检测转染后EC109细胞中miR-155-5p的表达水平收集4中转染24 h后的各组细胞,按qPCR试剂盒说明书进行检测和分析各组细胞中miR-155-5p的表达水平。6、细胞增殖买验(CCK8)我们将人食管鳞癌Eca109细胞分为五组。收集转染6 h后的各组细胞,接种于96孔板中,分别继续培养1,2,3d后,实验参照CCK8试剂盒说明书,在酶联免疫检测仪上读取450 nm波长处各孔的吸光度(OD)值。7、细胞凋亡实验(AnnexinV-PI双染法)我们将人食管鳞癌Eca109细胞分为五组。收集转染24 h后的食管鳞癌Eca109细胞,以1000r/min离心5 min收集(1—5)x 105个细胞,实验参照AnnexinV-PI试剂盒说明书,1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。8、细胞划痕实验我们将人食管鳞癌Eca109细胞分为五组。将Eca109细胞接种至6孔板中,转染24 h后用枪头在6孔板中划痕,用无血清培养基洗涤去掉脱落细胞,加入无血清RPMI-1640培养基,于37℃、5%CO2继续培养。分别在划痕后0,24 h拍照,观察划痕愈合能力。9、统计学方法定量qPCR验证检测出有表达差异的miRNA,以达到阈值Ct值的最低循环数计算样本中miRNA的RNA拷贝数相对量。其相对表达量计算公式是2一△Ct和2-△△Ct表示,其中∧Ct=Ct目的-Ct内参U6,△△Ct=Ct癌组织—Ct癌旁组织。2—△△Ct代表癌组织与配对癌旁组织中的目的基因RNA拷贝数的比值。呈正态分布的配对资料用配对t-检验,呈非正态分布的配对资料用秩和检验,多组间的均数比较用单因素方差分析。用SPSS17.0软件来进行统计学分析,p<0.05为差异有统计学意义。结果1、食管鳞癌组织中miR-155-5p的表达水平高于癌旁组织。利用qPCR法对20例食管鳞癌组织及其相应癌旁组织中miR-155-5p的表达水平进行检测。以癌旁组织中miR-155-5p的表达水平为100%,则食管鳞癌组织中miR-155-5p的表达水平(529.42%)明显高于其相应的癌旁组织(P<0.01)。2、Eca-109细胞中miR-155-5p的转染效率检测。我们将人食管鳞癌Eca109细胞分为五组。Eca109细胞转染50 nmol/L miRNA-155-5p类似物及150 nmol/L抑制剂24 h后,利用qPCR对细胞内miR-155-5p的表达水平进行检测。结果显示,类似物转染组的miR-155-5p表达量较对照组显著提高(P<0.01),而抑制物组的miR-155-5p表达量较对照组显著降低(P<0.01)。提示该法可提高Eca-109细胞内miR-155-5p的表达量,可用于后续实验。3、miR-155-5p对食管鳞癌细胞增殖的影响。我们将人食管鳞癌Ecal 09细胞分为五组。将miR-155-5p类似物和抑制剂转染Eca109细胞24 h、48 h、72 h后,利用CCK8法对各组细胞的细胞活力进行检测。实验发现,在转染后24 h、48 h、72 h类似物组及抑制剂组的细胞活力与对照组(100%)相比,均未见显著性差异(P>0.05)。提示,miR-155-5p类似物及抑制剂转染对Eca109细胞的增殖无明显影响。4、miR-155-5p对食管鳞癌细胞凋亡的影响。我们将人食管鳞癌Eca109细胞分为五组。收集转染后各组细胞进行AnnexinV/PI双染,利用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡,以评价miR-155-5p对食管鳞癌细胞凋亡的影响。结果显示,类似物转染组的细胞凋亡率为5.43%±3.09%,较对照组(5.67%±1.99%)无明显变化(P>0.05)。同时,抑制剂组的细胞凋亡率为5.26%±1.98%,较对照组亦无明显变化(P>0.05)。表明转染24 h后,miR-155-5p对Eca109细胞的凋亡无明显影响。5、miR-155-5p对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。我们将人食管鳞癌Eca109细胞分为五组。划痕实验的结果表明,转染miR-155-5p类似物24 h后,Eca109细胞的迁移能力较空白对照组显著提高(P<0.05)；而抑制剂组的细胞迁移能力无明显影响(P>0.05)。这提示上调miR-155-5p的表达可促进Eca109细胞的迁移。结论1、食管鳞癌组织中miR-155-5p的表达明显上调,可能与食管鳞癌的发生发展有关。2、上调miR-155-5p的表达对Eca109增殖和凋亡未见明显影响,显著促进了Eca-109细胞的迁移。3、下调miR-155-5p的表达对Eca109增殖凋亡和迁移未见明显影响4、miR-155-5p的表达变化可能与食管鳞癌转移有关。