研究背景随着社会经济的快速发展,各种事故频发；地震、海啸、泥石流等自然灾难也时常发生。四肢开放性损伤日趋增多,而且常常因为巨大的暴力导致皮肤及软组织大面积缺损,骨骼、肌肉、血管、神经等重要结构外露。创面经常被严重的污染,虽然经过彻底清创及积极抗感染等治疗,但创面感染仍然经常发生,甚至因为严重的感染无法有效地控制而被迫进行截肢,给患者及社会都带来沉重的负担。长期以来,因为抗生素的不合理运用,产生了以超级细菌为代表的耐药菌：同时,也因为严重创伤导致的大面积皮肤软组织缺损或者血管损伤等使创面局部的血液循环差,静脉使用抗生素有时候很难在创面局部形成有效的杀菌浓度。开放性创伤彻底清创是控制和预防感染的重要环节之一,但是清创后创面的临时覆盖,残留病原微生物的清除以及如何有效刺激肉芽组织的生长最终覆盖创面等多个环节同样存在诸多问题,这些都为严重创面的治疗提出了挑战。负压封闭引流技术(VSD)由Fleischmann博士在1992年首创并用于开放性损伤的治疗,现在已经被广泛用于各种开放性创伤的治疗并取得了较为良好的疗效,特别是应用在大范围皮肤软组织缺损不适合一期清创皮瓣转移覆盖的情况。许多研究发现VSD可以有效促进伤口血液循环,增加局部血供,刺激肉芽组织生长和抑制细菌繁殖等。但是在运用VSD过程中也可能出现引流管堵塞,分泌物增多及感染加重等问题。一旦出现明显的感染,VSD装置必须尽快拆除或者更换,这样会明显的增加患者的痛苦,延长住院时间以及增加医疗费用等。随着VSD技术的快速发展,现在已经有自带冲洗管道的VSD装置,可以通过冲洗管道注入不同的冲洗液如生理盐水或庆大霉素溶液等,冲洗液在一定程度上起到稀释分泌物,减少引流管堵塞的作用。但是生理盐水没有抗菌作用,尽管庆大霉素溶液有一定抗菌性,可是局部运用抗菌作用有限而且可能增加细菌耐药的风险。臭氧及臭氧水具有强氧化性和高效的非特异性杀菌作用,已经被广泛用于口腔炎症,皮肤感染,糖尿病足等多种感染性疾病。臭氧及臭氧水作为一种强氧化剂,不仅可以对创面进行迅速的杀菌,而且研究表明还可以促进创面愈合。臭氧及臭氧水杀菌还不具有细菌耐药的优点,而细菌对抗生素耐药正是目前所有抗生素所面临的共同问题。创面感染主要是因为存在各种病原微生物,结合我科多年创面分泌物细菌培养的结果及近年来文献报道总结出目前创面主要的病原菌有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、大肠杆菌、MRSA、白色念珠菌等,其中以铜绿假单胞菌最为常见。这些细菌在体外的条件下臭氧水对其杀菌效率尚缺乏统一的报道,所以设计臭氧水对这几种细菌的体外杀菌实验来初步判体外条件下臭氧水杀菌效率及浓度选择,为下一步VSD联合臭氧水治疗感染创面的动物实验中臭氧水浓度选择提供参考。另外,我们假设联合VSD和臭氧水的优点可能在感染性创面的治疗上会产生更好的结果。感染性创面可能通过VSD冲洗管注入一定浓度的臭氧水能更为有效的杀菌和更为快速的恢复,因此,我们设计铜绿假单胞菌感染创面的动物模型来验证。本实验研究主要分二部分,第一部分为臭氧水对感染创面常见细菌灭菌效果的实验观察,第二部分为负压封闭引流(VSD)联合臭氧水冲洗治疗感染创面的动物实验研究。第一部分不同浓度臭氧水对感染创面常见细菌的灭菌实验目的：研究不同浓度臭氧水对感染创面常见细菌的灭菌效果。方法：制取1mg/L、5mg/L、10mg/L三种不同浓度的臭氧水,选择生理盐水作为阴性对照。对感染性创面常见细菌金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、MRSA进行杀菌实验,计算不同浓度臭氧水对这7种细菌的杀菌率。结果：浓度为1mg/L臭氧水对本实验7种细菌杀菌率均可达95.5%；浓度为5mg/L臭氧水对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、白色念珠菌四种细菌杀菌率均大于99.9%,而对MRSA、大肠杆菌、铜绿假单胞菌杀菌率均为100%；浓度为10mg/L臭氧水对本实验的7种细菌杀菌率均为100%。结论：体外实验表明5mg/L及以上浓度的臭氧水可以有效杀灭感染创面常见的细菌。第二部分负压封闭引流联合臭氧水治疗感染创面的动物实验研究目的：探讨负压封闭引流(VSD)技术联合臭氧水冲洗治疗感染创面的疗效及相关的作用机制。方法：将40只Wistar大鼠随机均分为5组：A组：VSD联合5mg/L臭氧水冲洗组,B组：VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组,C组：VSD联合庆大霉素溶液冲洗组,D组：VSD联合生理盐水冲洗组,E组：常规换药组。实验前24hWistar大鼠背部剃毛,然后用质量百分比为6%的硫化钠在大鼠脊背侧脱毛备皮,术前8h禁止食物和水。麻醉后Wistar大鼠背部消毒铺无菌巾,制备3cm×2cm皮肤缺损创面深达肌层,常规压迫止血后涂抹已制备好的铜绿假单胞菌菌悬液并用敷料覆盖。动物造模后常规喂养,48h后观察成功建立铜绿假单胞菌感染模型,立即行病灶清除及压迫止血,安置VSD装置贴膜并检验无漏气。术后各冲洗组负压持续引流并经冲洗管分别注入5、10mg/L臭氧水、庆大霉素溶液及生理盐水冲洗1次/12h,常规换药组换药1次/d,共5d。每组麻醉后、造模48h后及治疗5d时行白细胞总数检测,局部组织肿瘤坏死因子-α (TNF-α)及表皮生长因子(EGF)含量测定。治疗5d局部组织行HE染色观察炎性反应。统计学处理：应用SPSS13.0(Chicago, Illinois)统计学软件,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,VSD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组、VSD联合庆大霉素溶液冲洗组、VSD联合生理盐水冲洗组、常规换药组的白细胞总数、TNF-α及EGF含量在麻醉后、造模48h后及治疗5d时比较采用重复测量General Linear Model中的Repeated Measures进行分析,治疗5d时各组白细胞总数、TNF-α、EGF含量比较采用Compare Means中的One-Way ANOVA进行分析,若差异有统计学意义,采用LSD法进行组间两两比较,P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1.动物造模成功后及治疗5d时各组创面的外观40只Wistar大鼠均造模成功,无动物死亡。造模48h后创面及敷料见大量绿色分泌物,局部红肿触之易出血。治疗5d时VSD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组疗效优于其他各组,以VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组疗效最好。2.各组不同时间点白细胞总数的变化各组白细胞总数在麻醉后、造模48h后及治疗5d时的多重比较差异均有统计学意义(P<0.05),造模48h后各组白细胞总数均升高,经治疗降低。治疗5d时VSD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组、VSD联合庆大霉素溶液冲洗组白细胞总数明显低于VSD联合生理盐冲洗组、常规换药组；VSD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组白细胞总数低于VSD联合庆大霉素溶液冲洗组,差异均有统计学意义(P<0.05),但VSD联合5mg/L臭氧水冲洗组与VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.各组不同时间点TNF-α及EGF含量的表达各组TNF-α表达在麻醉后、造模48h后及治疗5d时多重比较差异有统计学意义(P<0.05),造模48h后各组TNF-α均升高,经治疗降低。治疗5d时VSD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组、VSD联合庆大霉素溶液冲洗组TNF-α表达明显低于VSD联合生理盐冲洗组、常规换药组；VSD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组TNF-α表达明显低于VSD联合庆大霉素溶液冲洗组,差异均有统计学意义(P<0.05)；VSD联合5mg/L臭氧水冲洗组与VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组比较差异有统计学意义,VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组最低(P<0.05)。各组EGF表达在麻醉后、造模48h后及治疗5d时多重比较差异有统计学意义(P<0.05),造模48h后及治疗5d时各组EGF明显升高。治疗5d时VSD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组、VSD联合庆大霉素溶液冲洗组EGF表达明显高于VSD联合生理盐冲洗组、常规换药组；VSD联合5、10mg/L臭氧水冲洗组EGF表达明显高于VSD联合庆大霉素溶液冲洗组,差异均有统计学意义(P<0.05)；VSD联合5mg/L臭氧水冲洗组与VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组比较差异也有统计学意义,VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组最高(P<0.05)。4.HE染色光学显微镜观察结果治疗5d时各组HE染色光镜观察结果显示：VSD联合5mg/L臭氧水冲洗组见部分炎性反应细胞浸润,VSD联合10mg/L臭氧水冲洗组见少量的炎性反应细胞侵润,VSD联合庆大霉素溶液冲洗组见较多炎性反应细胞侵润,VSD联合生理盐水冲洗组和常规换药组见大量的炎性反应细胞浸润。结论：与常规换药及VSD联合庆大霉素溶液或者生理盐水冲洗相比,VSD联合臭氧水冲洗治疗更能促进铜绿假单胞菌感染性创面的愈合,其机制可能和上调EGF,抑制TNF-α的表达有关。