小开放阅读框编码肽（SEP）是由小开放阅读框（sORF）编码的序列长度小于100个氨基酸的小肽,普遍存在于诸多物种中,且具有广泛的生物学功能。生物信息学研究表明,生物体内还存在大量的SEPs没有被鉴定到。而SEPs的准确鉴定是挖掘其生物学功能的关键第一步,因此高效的SEPs检测分析方法显得尤为重要。基于质谱的蛋白质组学技术能够检测到由小开放阅读框翻译得到的SEPs产物,为转录本的编码潜能和SEPs的存在提供直接证据。但由于SEPs具有分子量小、丰度低等特点,目前的组学手段对SPEs的鉴定率不高。为了提高小开放阅读框编码肽的鉴定效率,我们将肽组学中传统的有机溶剂沉淀方法应用于SEPs的提取和鉴定。本研究利用有机溶剂乙腈（ACN）和盐酸（HCl）进行SEPs的提取和富集,结合小分子蛋白凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）和静电排斥亲水色谱（ERLIC）分馏两种分离方法对人类肝癌细胞系Hep3B中的小开放阅读框编码肽进行了鉴定。首先,我们对比了不同方法对小蛋白和SEPs的富集、分离和鉴定效果。通过对比两种提取方法发现,ACN法对更低分子量和更疏水的小蛋白和SEPs有很好的富集效果,并且能提高随后的质谱鉴定效率;HCl法虽然背景干扰多,但序列覆盖度更高。在小蛋白提取富集后辅以适当的分离手段,可以提高小蛋白和SEPs鉴定的数量和质量。不同方法联用能够实现优势互补,从而提高小开放阅读框编码肽的鉴定效率。随后,我们对本次实验中鉴定到的小蛋白和SEPs进行筛选。通过去除已注释蛋白序列和同源比对,最终得到了 285个独特肽段,对应271个新SEPs。在这些新SEPs中只有3个被报道具有翻译水平的测序证据,其余268个均处于预测水平。结合转录本及基因上的定位信息分析发现,85%的新SEPs由过去认为的非编码区域编码产生。最后,通过结构域和同源性比对分析发现,新SEPs中有70个具有预测结构域,114个具有跨物种的同源性,预示着这些SEPs可能具有一定的生物学功能。例如,IP661898具有COX6C结构域,与蛋白细胞色素C氧化酶亚基6C（COX6C）具有76.1%的序列同源性,且在7个物种中具有保守性;IP789354具有TCTP结构域,与翻译控制的肿瘤蛋白（TPT1）具有80.0%的序列同源性,且在6个物种中具有保守性。同时,本研究鉴定到22个上游开放阅读框编码肽,这类SEPs往往对其下游基因的翻译表达具有调控作用。本研究综合利用不同的提取和分离方法,提高了 SEPs的鉴定效率,与此同时,首次在人类肝癌细胞系Hep3B中进行SEPs的鉴定。本研究结果为271个开放阅读框的编码提供了证据,是对人基因组和蛋白质组的补充,同时也为这些SEPs后续的功能研究提供了有力的理论依据和数据支持。