【摘 要】
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C型尼曼-匹克蛋白2（Nieman-Pick type C2 protein,NPC2）是一种小分子的溶酶体蛋白。在节肢动物中NPC2蛋白参与多种信息化学物质的结合和识别,为嗅觉相关分子。为了进一步探究NPC2蛋白在蜱的嗅觉感受系统中的作用,本研究以长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）为研究对象,首次展开了长角血蜱NPC2蛋白的鉴定及其生物学功能初步探究,旨在寻找新的驱避
【基金项目】
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“新疆南疆地区野生动物蜱种分布调查及蜱带病原的多样性研究”的部分研究成果（项目编号:31960705）课题主持人:武军元副教授（塔里木大学）；
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C型尼曼-匹克蛋白2（Nieman-Pick type C2 protein,NPC2）是一种小分子的溶酶体蛋白。在节肢动物中NPC2蛋白参与多种信息化学物质的结合和识别,为嗅觉相关分子。为了进一步探究NPC2蛋白在蜱的嗅觉感受系统中的作用,本研究以长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）为研究对象,首次展开了长角血蜱NPC2蛋白的鉴定及其生物学功能初步探究,旨在寻找新的驱避靶点,为蜱的防控提供帮助。1.HL-NPC2的克隆及序列分析采用PCR技术对长角血蜱的NPC2基因进行了克隆,发现HL-NPC2的ORF全长序列为468 bp,编码155个氨基酸。序列分析结果显示该蛋白为稳定蛋白,在其ORF内有1个大小相同的ML结构域,说明HL-NPC2属于ML结构域家族成员;跨膜结构预测证明了HL-NPC2蛋白不是跨膜蛋白。2.HL-NPC2的原核表达及多克隆抗体的制备克隆出HL-NPC2基因后,将其序列连接到表达载体p ET30a上,成功构建好HL-NPC2/p ET30a原核表达载体后对该重组蛋白进行表达纯化,并用此蛋白制备出HL-NPC2鼠抗多克隆抗体,同时用合成的多肽制备出HL-NPC2鼠抗多克隆抗体。用ELASA酶联反应法来检测制备的HL-NPC2多克隆抗体的效价,结果发现两种抗体都识别了纯化的HL-NPC2重组蛋白,且用HL-NPC2重组蛋白制备的抗体效价更高一些。通过蛋白质印迹（Western blot）来鉴定HL-NPC2多克隆抗体,发现制备的抗体可特异性识别HL-NPC2的重组蛋白,条带大小约为25 k Da。后续对长角血蜱不同组织器官中天然NPC2蛋白进行了Western Blot检测,结果表明长角血蜱不同组织器官中均存在HL-NPC2的天然蛋白表达。3.HL-NPC2的差异表达分析利用qRT-PCR技术检测了HL-NPC2在各个阶段的长角血蜱以及长角血蜱成蜱不同吸血阶段的各个组织的基因转录水平。结果显示NPC2蛋白不仅在长角血蜱各个阶段中都有表达,还在长角血蜱成蜱的吸血和饱血阶段的各个组织器官中均能转录。4.HL-NPC2的生物学功能初探首先进行了HL-NPC2的RNA干扰研究,采用RNAi技术合成HL-NPC2的双链RNA后,对长角血蜱NPC2基因做了体内干扰,干扰之后对蜱的生物学特征进行观察,并通过qRT-PCR技术检测了RNA干扰后HL-NPC2基因的转录水平。随后进行了长角血蜱NPC2的嗅觉相关性试验,用肉桂精油、氨水、二氧化碳等化学物质来刺激蜱虫,采用实时荧光定量PCR技术对这些化学物质刺激过后HL-NPC2的转录情况进行检测。结果显示干扰后无论是吸血、饱血阶段的长角血蜱成蜱还是其各个组织,实验组相对于对照组的转录水平均显著性下降;用二氧化碳、氨水、肉桂精油等化学物质刺激长角血蜱后,NPC2转录水平都有明显变化,肉桂精油的效非常显著。总之,本研究克隆和鉴定了长角血蜱嗅觉相关的NPC2蛋白分子,发现其与肉桂精油刺激反应直接有关。结果为蜱的驱避剂开发提供了重要方向。
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