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BCRP(breast cancer resistant protein)与乳腺癌耐药性关系最为密切,但调控机制不明确。范可尼贫血中。FA/BRCA通路功能缺失可激活MAPK系统,下调BCRP表达。FANCF作为FA/BRCA通路关键因子调控肿瘤细胞耐药性作用引起学者关注,但乳腺癌中未见相关报道。课题组发现:乳腺癌细胞中FANCF基因低/失表达可干扰FA/BRCA通路生物学功能,降低BCRPmRNA表达及对阿霉素的抵抗性;但乳腺癌细胞中FANCF调控BCRP表达与耐药性是否通过MAPK系统尚需验证。为此,本研究以FANCF和BCRP同时作为切入点,构建FANCF基因沉默及BCRP过表达乳腺癌细胞模型;在体外水平检测不同基因特性细胞生长表型、耐药性,分析FANCF基因沉默和BCRP过表达使FA/BRCA,MAPK通路对化疗药物丝裂霉素(MMC)诱导的DNA损伤的反应性和生物学功能的异同。研究结果将为在乳腺癌药物治疗中,发现预防和/或逆转耐药的新切入点和基因靶点,提供理论与实验的依据。
实验方法
应用小提中量试剂盒提取质粒并进行基因测序,脂质体法转染人乳腺癌MCF-7细胞,MDA-MB-435S细胞,RT-PCR及Westernblot检测FANCF及BCRP基因mRNA和蛋白表达水平,确认干预FANCF和BCRP细胞模型构建成功;FANCF基因沉默及BCRP过表达并用丝裂霉素(MMC)作用后,分别采用MTT法、流式细胞仪JC-1染色法及FITC/PI双染法检测细胞增殖、线粒体膜电位及凋亡的改变,采用Transwell小室法检测细胞迁移及侵袭力的改变以及彗星实验检测DNA损伤情况等生物学特性的变化,采用流式细胞仪检测细胞内阿霉素浓度变化。并用Westernblot检测BCRP,FANCD2及MAPK通路相关因子的表达。
实验结果
1.MCF-7和MDA-MB435S细胞在转染pSliencerTM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒并在MMC作用24h后,阳性转染组和阴性对照组相比,在生长表型方面:细胞存活率,细胞线粒体膜电位,细胞侵袭力和迁移力显著下降(P＜0.05),而细胞凋亡以及细胞DNA断裂损伤这显著增加(P＜0.05),细胞内阿霉素浓度显著升高(P＜0.05)。MCF-7和MDA-MB-435S细胞在转染pSliencerTM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒并在MMC作用24h后,阳性转染组和阴性对照组相比MAPK通路相关因子(JNK,p38,c-fos,c-Jun)表达量明显升高。BCRP的表达量则明显降低。FANCD2的表达量也明显降低。
2.与阴性对照组相比,转染pcDNA3.1/BCRP质粒后,MCF-7细胞和MDA-MB-435S细胞中BCRP基因mRNA及蛋白表达水平均明显升高,转染后48h、72h,MCF-7细胞及MDA-MB-435S细胞BCRPmRNA表达率分别增加了84.23％±15.96％,132.09％±18.80％和107.80％±17.68％,182.93％±11.65％(P＜0.05);WesternBlot结果显示,转染后48h及72h,MCF-7细胞及MDA-MB-435S细胞BCRP蛋白表达率分别增加了65.47％±19.77％、28.42％±8.87％和17.46％±5.64％、72.71％±19.17％(P＜0.05),说明干预BCRP基因48h、72h时能显著提高mRNA及蛋白表达,BCRP过表达的瞬时转染MCF-7和MDA-MB-435S细胞模型成功建立。
3.两细胞在转染pcDNA3-1-BCRP-cDNA质粒并在MMC作用24h后,阴性对照组和阳性转染组在细胞生长表型方面:细胞存活率,细胞线粒体膜电位显著增加(P＜0.05),细胞凋亡,细胞侵袭力和迁移力无明显变化(P＞0.05)。而细胞DNA断裂损伤略有降低(P＞0.05),细胞内阿霉素浓度显著降低(P＜0.05)。两细胞间相同处理因素下,除转染pcDNA3-1-BCRP-cDNA质粒并用MMC处理24h后细胞存活率MCF-7较高之外(P＜0.05),其余各指标均无显著性差异(P＞0.05)。两细胞在转染pcDNA3.1-BCRP-cDNA质粒并在MMC作用24h后,阳性转染组和阴性对照组相比MAPK通路相关因子(JNK,p38,c-fos,c-Jun)表达量明显降低。FANCD2的表达量变化不明显。
结论
1.干预MCF-7和MDA-MB-435S细胞的FANCF基因(采用RNA干扰技术使FANCF基因沉默)可使两细胞在IC50浓度MMC作用下和干预前相比,细胞存活率显著下降,细胞早期和晚期凋亡显著增加,细胞线粒体膜电位显著降低,细胞侵袭力和迁移力显著下降,细胞DNA断裂损伤加剧,细胞内阿霉素浓度升高,总之使细胞对MMC的敏感性升高;
2.干预MCF-7和MDA-MB-435S细胞的FANCF基因(采用RNA干扰技术使FANCF基因沉默)可能通过上调MAPK通路相关因子(JNK,p38,c-fos,c-Jun)表达,降低FANCD2的表达,使BCRP表达量降低,进而使细胞对MMC的敏感性升高来降低两种细胞对MMC的耐药性;
3.成功构建pcDNA3.1/BCRP真核表达载体及BCRP过表达的瞬时转染MCF-7和MDA-MB-435S细胞模型;
4.干预MCF-7和MDA-MB-435S细胞的BCRP基因(转染pcDNA3.1-BCRP-cDNA质粒)可使两细胞在IC50浓度MMC作用下和干预前相比,细胞存活率显著升高,细胞早期和晚期凋亡减少,细胞线粒体膜电位显著升高,细胞侵袭力和迁移力不变或略有增加,细胞DNA断裂损伤略有减弱,细胞内阿霉素浓度降低,总之使细胞对MMC的敏感性降低;
5.干预MCF-7和MDA-MB-435S细胞的BCRP基因(转染pcDNA3.1-BCRP-cDNA质粒)可能通过在BCRP表达量升高之后,下调MAPK通路相关因子(JNK,p38,c-fos,c-Jun)表达,进而使细胞对MMC的敏感性降低来提高两种细胞对MMC的耐药性。