目的:　　1、采用纳米技术及透析技术从传统藏药中提取并制备不同分子量的纳米颗粒（纳米载药颗粒和未载药纳米颗粒），并进行粒径分析，表面电荷分析等一系列表征。　　2、探讨不同的纳米颗粒对体外SHSY-5Y细胞生长的影响。本实验采用两种不同的纳米载药颗粒分别处理人神经母细胞瘤细胞SHSY-5Y，检测纳米颗粒对SHSY-5Y细胞活力的影响，检测载药纳米颗粒对细胞NF-kappaB活性的影响，对比分析不同的纳米颗粒对SHSY-5Y细胞生物学特性影响是否存在差异。　　方法:　　1、二十五味珊瑚丸注射液的制备　　将1g二十五味珊瑚丸碾碎→加入10ml去离子水中重悬→放入37℃水浴锅中水浴1h→用超声粉碎仪（功率130Watts，频率60％）在0℃超声10min→16000g离心30min。吸取上清液，冻干得到载药纳米颗粒(drug-loaded nanoparticles)　　将1g二十五味珊瑚丸碾碎→加入10ml去离子水中重悬→放入37℃水浴锅中水浴1h→用超声粉碎仪（功率130Watts，频率60％）在0℃超声10min→16000g离心30min。吸取上清液，8Kd透析膜透析4天（4-6h换水一次），冻干，得到无载药纳米颗粒（drug-free nanoparticles）　　2、粒度分析和表面电荷检测　　纳米颗粒直径分布（平均直径和多分散性指数）以及Zeta电位利用马尔文激光粒度仪（马尔文仪器，英国）测量。在测量之前，将样品悬浮于蒸馏水中，然后在25℃和90度的散射角进行测量。对于每个样品的检测结果，应用多方差分析。　　3、细胞培养　　购入人神经母细胞瘤细胞SHSY-5Y（ATCC细胞库），复苏后传代，将其培养在含有10％胎牛血清，0.1％青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基中，于37℃，含5％ CO2的培养箱中常规培养。　　4、荧光纳米颗粒追踪定位及细胞形态观察　　激光共聚焦扫描显微镜追踪细胞对载药纳米颗粒和未载药纳米颗粒的吸收摄取情况，以及纳米颗粒在SH-SY5Y细胞内的分布。SHSY-5Y细胞按2×105个细胞/孔密度接种于24孔板爬片中，培养过夜。以不同的纳米颗粒（载药纳米颗粒、未载药纳米颗粒）分别处理细胞4h、8h，在室温下用4％多聚甲醛固定，用DAPI染色30min。将盖玻片放置在载玻片上，通过激光共聚焦扫描显微镜，分别使用蓝色激发光(405nm)，绿色激发光(488nm)和红色激发光(568nm)观察拍照。　　5、透射电镜(TEM)　　运用透射电镜观察纳米颗粒与细胞间的相互作用，以及纳米颗粒在细胞内的转移。将SHSY5Y细胞预先培养24小时，后用不同的纳米颗粒分别处理SHSY-5Y细胞4h、8h。然后将悬浮的纳米颗粒液体吸出，细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化并分别收集细胞到离心管中，之后用2.5％戊二醛固定，再用锇酸，不同浓度梯度的丙酮脱水。然后将样品包裹在环氧树脂中，切片，电镜观察。　　6、CCK-8检测细胞毒性　　细胞毒性通过CCK-8试剂盒检测。以每个孔9000个SHSY-5Y细胞的密度种于96孔板中培养24h之后，将培养基换成新鲜的不加血清的培养基。载药纳米颗粒和不载药的纳米颗粒分别加入不同组内（每组6个复孔）。经过6h的共同孵育，CCK-8试剂盒检测共培养6h细胞的增殖凋亡情况。向每个孔内分别加入10ulCCK-8液和90ul培养基，然后孵育两个小时。通过酶标仪测量450nm吸光度值。　　结果：　　1、成功从二十五味珊瑚丸内提取得到不同粒径的纳米颗粒。　　用研钵磨碎二十五味珊瑚丸获得二十五味珊瑚丸的粉末。粉末在不同的激发光下显示出不同的荧光。二十五味珊瑚丸中大量的不溶成分因粒径特征阻碍其进入细胞。　　我们试图从二十五味珊瑚丸中提取载药纳米颗粒。由于水溶性差，二十五味珊瑚丸粉末悬浮在水中，在不同条件下离心两次以收集上清液。将上清液冷冻干燥，得到含有药物有效成分的纳米颗粒。在透射电子显微镜下，可以观察到各种粒径的纳米颗粒。　　为了探索二十五味珊瑚丸中的纳米颗粒的生物活性，我们分别制备了两种纳米颗粒，载药纳米颗粒和未载药纳米颗粒，前者直接从二十五味珊瑚丸中提取，而后者是从由前者经过透析膜(MWCO7000Daldo)透析4d处理获得，分别对载药纳米颗粒和药物的纳米颗粒的粒度和表面电荷进行分析。　　2、粒径分析结果显示，大约84.4％的未透析的纳米载药颗粒的直径范围主要波动在68.6nm至122.4nm内。相比而言，几乎90％透析的纳米颗粒直径范围主要波动在37.84nm至58.77nm。很明显，未透析的纳米载药颗粒直径大于透析的纳米颗粒。这个实验数据表明经透析过的纳米颗粒可能有效药物成分已被去除。从整个粒径分布看，未透析的纳米载药颗粒的直径分布在78.82nm至1106nm，是一个连续的区间。然而透析过的纳米颗粒的直径分布在两个区间，37.84nm至78.82 nm，220 nm至615nm;透析的纳米颗粒缺少了区间(78.82 nm至220 nm)，这表明了透析的纳米颗粒尺寸不同，具有离散值，暗示了可能不同的纳米载体具有不同的载药率。进一步的研究表明较多的未透析的纳米载药颗粒的zeta电位在-21.5mV，而更多的透析的纳米颗粒的zeta电在-9.31 mV。很明显，载药纳米颗粒经透析去除了携带的药物之后，负电荷离子的数量减少，间接说明药物可能携带负电荷。通过结果可以判断出，纳米载体可以中和药物的负电荷，使药物更容易渗透进入细胞。　　3、荧光纳米颗粒激光共聚焦观察和透射电镜观察　　由于二十五味珊瑚丸的水溶性差和成分复杂，在处理细胞时起作用的有效成分还不清楚。为了检测载药纳米颗粒对细胞的影响，SH-SY5Y细胞分别与载药纳米颗粒和未载药纳米颗粒共培养，在共聚焦显微镜的视野下观察。由于二十五味珊瑚丸的纳米颗粒在不同的激发光下可被激发出不同的荧光，其在细胞内的分布定位可以通过激光共聚焦显微镜检测到。结果证明载药纳米颗粒可进入细胞的细胞核，而未载药纳米颗粒却分布于整个细胞内。　　通过透射电子显微镜结果可以得出结论，纳米颗粒的细胞摄取可以分为两个步骤。首先，纳米颗粒结合在细胞膜上，这是纳米颗粒的表面电荷和细胞膜表面电荷相互的作用。第二，就是纳米颗粒进入细胞核。这个过程中，可以看到细胞核的核膜。这表明，纳米颗粒可能在核膜形成通道，纳米粒子进入细胞核。　　激光共聚焦结果表明，用500μg/ml的载药纳米颗粒处理的SH-SY5Y细胞核均比41.5μg/ml的未载药纳米颗粒处理的SH-SYSY细胞核大，这表明载药纳米颗粒可以诱导细胞核肿胀，也就是细胞肿胀，而未载药的纳米颗粒不会。载药纳米颗粒处理组的细胞几乎边界不能观察到。同时，未载药纳米颗粒处理组的细胞边界可清晰观察到。载药纳米颗粒和未载药纳米颗粒处理组的细胞的红色荧光的强度几乎相同，但通过对比看出，未载药的纳米颗粒处理组的细胞的绿色荧光的强度变得明显弱于与载药纳米粒子处理组。此结果显示，纳米颗粒自身在相应的激发光下可发出红色荧光，而有效药物成分在相应的激发光下可发出绿色荧光，经透析处理的纳米颗粒，由于有效药物成分的减少，与未经透析处理的纳米颗粒相比，显示出绿色荧光减弱。　　4、CCK-8检测细胞活性　　CCK-8用于检测分别用载药纳米颗粒或未载药纳米颗粒处理的SH-SY5Y细胞的生物活性。在这项研究中，细胞用不同浓度的载药纳米颗粒和不含药物的纳米颗粒，分别作用6个小时。每个实验组6个复孔，实验分别重复三次。结果显示，16.6μg/ml的未载药纳米颗粒处理(NP200，对应于从为200μg/ml的载药纳米颗粒进行透析的总纳米颗粒)6h后，OD值比载药纳米颗粒处理组高，这表明低浓度未载药纳米颗粒可以诱导细胞增殖。然而，在相同条件下，200μg/ml的载药纳米颗粒处理细胞不能诱导细胞增殖，用2000μg/ml的载药纳米颗粒处理6h，细胞增殖受到抑制，而166μg/ml的未载药纳米颗粒(NP2000，对应于从2000μg/ml的载药纳米颗粒进行透析得到的纳米颗粒浓度)没有明显效果。这些结果表明，纳米颗粒携带的药物是对细胞产生毒性的主要来源，而未载药的纳米颗粒是相对无毒的。　　5、Western blot分析显示，500μg/ml的载药纳米颗粒处理细胞8h可以减少NF-κB/P65蛋白的表达和P65磷酸化的表达。根据以上数据，载药纳米颗粒可对NF-κB信号转导通路（与细胞凋亡相关的转录因子）产生影响。　　结论:　　根据这项研究，广泛存在于二十五味珊瑚丸中的纳米颗粒，在携带药物方面起到了重要的作用。本实验表明纳米颗粒本身对细胞无毒性，不能诱导细胞的肿胀。然而，载药纳米颗粒可能作为药物有效成分的载体，增加药物对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞毒性。纳米颗粒可以在核膜上形成通道，协助药物进入细胞核。这是二十五味珊瑚丸中载药纳米颗粒渗透细胞核，并引发SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞肿胀最主要的原因。蛋白印迹的结果证明，载药纳米颗粒的毒性与NF-κB信号通路相关，通过减少NF-κB/p65蛋白及其磷酸化蛋白表达来实现。本研究结果为二十五味珊瑚在脑血管疾病和神经疾病的治疗研究奠定了一定基础。