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我国是养鸭大国,占全世界养殖量70%以上。但随着养殖量的增加,鸭的病毒性疾病逐年增加,并日趋复杂,给养鸭业带来了巨大的损失。病毒性雏鸭肝炎是一种主要侵害3周龄以内的雏鸭的疾病,在病毒感染过程中,主要侵害T淋巴细胞。CD8作为T淋巴细胞表面的重要标志物,在抗病毒感染和细胞免疫体系中起着非常重要的作用。CD8α参与胸腺分化以及T细胞活化的信号传导,而CD8β主要协助CD8α发挥生物学功能。已有研究证明,CD8α基因表达的调节可能存在包括CD8α特异性增强子和可能的沉默子在内的多种顺式调控元件和反式作用因子。CD8α基因DNA甲基化的改变也受胸腺高移动性型框蛋白和IL4等多种因子影响,从而导致基因表达的变化或异常表达。而关于鸭的CD8α基因转录调控和表观遗传调控至今尚不清楚。本研究通过构建Ⅰ型雏鸭病毒肝炎感染模型,在成功克隆鸭CD8α基因cDNA序列和启动子区的基础上,对CD8α基因的表达特性和表达调控进行了初步分析,其主要研究结果如下：1.分别以金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭和斑嘴鸭的脾脏组织cDNA为模板进行RT-PCR扩增,成功获得了金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭和斑嘴鸭CD8α基因CDS区,其长度都为714bp。同时采用RACE技术克隆了金定鸭CD8a cDNA全序列,长为1624bp,包括61bp的5’UTR,849bp的3’UTR,714bp的开放阅读框(ORF)。同时检测了雏鸭肝炎易感组、抗性组和对照组的鸭CD8α编码序列,发现三者间主要突变发生在外显子2。2.以金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭和斑嘴鸭基因组DNA为模板,成功获得了金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭和斑嘴鸭基因(包含全部编码区和所有内含子,去除5’和3’非编码区序列)其CD8α基因编码区序列长分别为6568bp、6567bp、6488bp、6568bp和6577bp,都由6个外显子和5个内含子组成,除第一内含子外,其他内含子均符合"gt-ag"剪切法则。3.对不同禽类(金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭、斑嘴鸭、家鸡、红色原鸡、斑胸草雀和火鸡)CD8α基因编码序列进行了进化分析,樱桃谷北京鸭与绿头鸭氨基酸同源性最高达100%,同源性最低的是番鸭与家鸡,为61.3%；且在胞外区还发现了Cys49、Cys119、Cys182等3个保守性氨基酸残基；在蛋白质级结构上,9条序列的α螺旋和β折叠亦相似,说明在禽类中CD8α进化是相当保守的。4.通过RT-PCR和RT-qPCR,对鸭肌肉、肺、肝、大脑、小脑、胸腺、脾、肾脏和淋巴细胞等组织和细胞进行CD8α mRNA半定量和定量检测,发现鸭CD8α基因在胸腺、脾、肺和淋巴细胞中表达量较高,其次为肝、小脑和肾,肌肉和大脑中表达量最低。同时通过原位杂交技术检测了脾脏组织CD8α mRNA分布,发现鸭CD8α在脾脏白髓内阳性细胞分布密集,且易感组阳性细胞明显多于空白组。通过免疫组化技术检测了CD8α蛋白表达,发现在鸭脾脏白髓区的脾小结和淋巴鞘CD8α蛋白表达丰富。5.分别采用Ⅰ型雏鸭肝炎病毒和Poly(I:C)接种3日龄雏鸭,利用RT-qPCR对感染后鸭的胸腺、脾、肺等组织时空表达谱进行分析,发现各组织CD8α基因总体表现为先上升,48h下降至最低值,48h后又有上升趋势。同时采用ELISA技术检测了血清IFN-α等细胞因子变化情况,发现IFN-α、IFN-γ变化趋势与CD8α基因表达趋势一致。6.通过构建重组真核表达质粒pEGFP-C1-CD8α,对CD8α蛋白进行亚细胞定位分析,荧光显微镜观测结果显示,重组的EGFP-CD8α融合蛋白主要分布于NIT-3T3的细胞质中。7.运用基因组步移扩增,成功克隆了鸭CD8α基因5’端2480bp的片段,包括第一外显子56bp,启动子区2424bp,使用在线软件(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)分析鸭CD8α基因启动子区域,发现了Nkx-2、GATA-1、GATA-3、GATA-1、NKX-2、AP-1等多个与细胞增殖、细胞凋亡以及病变过程相关的潜在转录因子结合位点。8.通过制备一系列启动子缺失突变体(-625/-1bp,-1110/-1bp,-1413/-1bp,-2151/-1bp),定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,通过荧光发光仪检测发现,-625～-1110启动子活性最强,且-625～-1bp区域和-625～-1110均存在着正调控元件。并对易感组、抗性组和对照组CD8α启动子区转录活性区序列进行了比较,发现在不同处理组间存在3处碱基突变(-985T>C、-552G>A、-482G>A),其中,-985T>C突变导致易感组的CD8α基因增加1个MZF1转录因子结合位点,-552G>A突变导致易感组和抗性组的CD8α基因减少1个CpG岛位点。9.通过亚硫酸盐测序比较了雏鸭肝炎易感组、抗性组和对照组血液的CD8α基因的甲基化程度,发现易感组CD8α基因甲基化明显偏高(0.90±0.10),但与抗性组(0.73±0.15)和对照组(0.77±0.06)差异不显著(P>0.05)。且发现了第二个CpG位点上,在易感组中呈高度甲基化,而在抗性组和对照组的甲基化程度较低。10.采用MethylFlash整体甲基化定量试剂盒对易感组、抗性组和对照组整体甲基化水平进行检测,结果表明,易感组血液整体甲基化水平要显著高于抗性组和对照组(P<0.05)。