基于核酸探针与新型传感材料之间相互作用的生物分子检测

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近年来,肿瘤疾病的发病率持续上升,成为危害国民健康的主要杀手。疾病相关生物分子的高灵敏检测对于疾病的早期诊断及治疗具有重要的意义。生物传感检测作为一项多学科交叉的新兴技术,具有响应速度快、特异性强、可实时连续检测的优点。各类性能优异的新型传感材料的出现,为改善和提高生物传感器的性能提供了许多新的思路。水溶性共轭聚合物(conjugated polymers,CPs)是一类含有离域大π键结构的高分子材料,具有“分子导线”功能,可实现荧光信号的显著放大,从而提高生物传感器的灵敏度。氧化石墨烯(graphene oxide,GO)为石墨烯的衍生物,具有表面积大、易修饰、分散性好等特点。基于GO与荧光分子之间的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET),可设计高效的生物传感器。本论文将核酸探针与新型传感材料相结合,设计灵敏度高、特异性好、操作便捷的荧光生物传感器,实现对疾病相关生物分子的高效检测。论文研究包括以下三个部分:(1)基于核酸探针和水溶性共轭聚合物的S1核酸酶和ATP检测S1核酸酶是一种单链特异性核酸内切酶,在DNA复制、重组和修复等生物过程中发挥着重要作用,其活性及抑制剂的检测在生物分析、疾病诊断等方面具有重要意义。水溶性共轭聚合物(PPE-PLL)在水溶液中可形成聚集结构,由于自聚集引起的荧光猝灭,其荧光较弱。当PPE-PLL与ss DNA发生静电作用后后荧光显著增强。有S1核酸酶存在时,ss DNA被S1核酸酶剪切,PPE-PLL又形成聚集结构,荧光显著降低。进一步地,如果体系中同时存在ATP和S1核酸酶,PPE-PLL仍然会发射较强荧光,这是由于S1核酸酶的活性被ATP抑制的缘故。通过观察体系荧光的变化,可实现对S1核酸酶和ATP的检测。该方法无需标记、操作简单、选择性好,对S1核酸酶和ATP的检测限分别为0.15 U/m L和0.068 m M。(2)基于核酸探针和氧化石墨烯的T4多聚核苷酸激酶检测T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)可催化三磷酸腺苷(ATP)上的γ-磷酸基团转移到5’寡核苷酸或核酸的羟基末端,从而使核酸的5’末端磷酸化。T4 PNK水平的异常会导致非正常的DNA磷酸化,与某些人类疾病的发生密切相关。本课题将FAM-ds DNA探针和GO相结合,实现了对T4 PNK的灵敏检测。ds DNA的5’羟基端能被T4 PNK磷酸化,进一步被lambda核酸外切酶(lambda exonuclease,λexo)水解,将FAM-ss DNA释放出来并吸附在GO表面,使FAM的荧光被猝灭。没有T4 PNK存在时,FAM-ds DNA不能被磷酸化,所以不能被λexo水解。由于FAM-ds DNA不能吸附在GO表面,体系的荧光较强。该生物传感器对T4 PNK的检测限为0.08 U/m L,与其他方法相比,该方法操作简单、特异性强。(3)基于发夹DNA探针的T4多聚核苷酸激酶检测利用发夹DNA探针的结构可灵活变化的特点,实现对T4 PNK的“turn-on”模式的检测。该发夹探针的3’端修饰猝灭基团,在靠近5’端的T碱基上修饰荧光基团。当加入T4 PNK时,发夹探针的5’羟基末端被磷酸化。随后加入λexo,导致5’端的茎部分被水解,从而将荧光基团释放出来。通过加入靶标分子后荧光由猝灭状态到“turn-on”状态的变化,实现了对T4 PNK的检测,线性范围为0.5-7.5 U/m L,检测限为0.13 U/m L。该方法线性范围宽,并且操作便捷,可实现快速检测。
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