基于转录组技术的大鳞鲃盐碱胁迫免疫应激响应研究

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本研究通过设置不同的NaCl盐度梯度溶液和Na HCO3碱度梯度溶液以淡水为对照,对比分析了盐度和碱度的胁迫对大鳞鲃(Luciobarbus capito)不同胁迫时间肝、肾和鳃组织抗氧化水平的变化,以及血液理化指标、血清激素水平和组织结构的变化情况;并通过转录组测序技术,筛选了6个免疫相关差异表达基因,并验证了6个基因在不同组织中、不同胁迫时间下的时空表达差异,为进一步探究大鳞鲃在盐碱胁迫下的免疫响应机制奠定理论基础。研究结果表明,在试验7 d时,肝、肾和鳃组织的抗氧化水平,以及血液理化指标和血清激素水平均恢复至初始水平并趋于稳定,三种组织的结构中均未出现细胞坏死现象;各组织中免疫相关的基因亦在试验7 d时表达水平恢复至对照组水平。因此,大鳞鲃能够适应12 g/L NaCl盐度环境和40 mmol/L Na HCO3碱度环境。1、盐碱胁迫对大鳞鲃免疫相关生理生化指标及组织结构的影响为阐明NaCl盐度和Na HCO3碱度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织抗氧化系统、血液理化指标、激素水平以及组织结构的影响,本研究设置4个NaCl盐度组(3g/L,6 g/L,9 g/L,12 g/L),4个Na HCO3碱度试验组(10 mmol/L,20 mmol/L,30 mmol/L,40 mmol/L)和两个淡水对照组,检测分析了不同盐度、碱度胁迫下曝露7个时间点(3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,96 h和7 d)大鳞鲃肝、肾和鳃组织ACP、AKP、GSH-Px的活性和MDA含量的变化,血液WBC、淋巴细胞、中性粒细胞、RBC、血小板和血红蛋白含量以及血清中皮质醇和促肾上腺皮质激素含量的变化;观察分析了盐度、碱度胁迫下大鳞鲃肝、肾和鳃组织的结构适应性变化。实验结果显示:相同盐度、碱度胁迫下,大鳞鲃肝、肾和鳃组织中3种抗氧化酶活性、MDA含量,血液理化指标及血清激素水平均随胁迫时间的延长均呈现出先升后降,并于胁迫7 d内基本趋于稳定。此外,胁迫初期,在同一胁迫时间下,血液WBC、淋巴细胞、中性粒细胞、RBC以及血红蛋白含量均随着盐碱度的升高呈现出显著上升的变化趋势(P<0.05);而在相同盐度、碱度下,血液指标均呈现出显著上升的变化趋势(P<0.05),随着胁迫时间的延长,5种指标均在24 h内时达到顶峰,之后逐步下降并恢复至对照组水平;但血小板水平在整个试验过程中无显著变化(P>0.05)。在12 g/L NaCl盐度和40 mmol/L Na HCO3碱度胁迫7 d后,肝组织中肝细胞出现不同程度空泡化现象,各级肾小管亦均出现不同程度的萎缩,鳃小片中则呈现出细胞肿胀、鳃小片之间间隙增大等现象。综上,在高盐碱度胁迫下,大鳞鲃通过自身调节,各项免疫指标均可恢复至正常水平并达一个新的平衡,且组织结构中未有细胞坏死,表明大鳞鲃对12 g/L NaCl和40 mmol/L Na HCO3盐、碱度环境有较强的适应能力。2、盐碱胁迫下大鳞鲃脾脏组织的转录组分析通过转录组测序技术,对12 g/L NaCl盐度试验组、40 mmol/L Na HCO3碱度实验组和淡水对照组的大鳞鲃脾脏进行了转录组测序,摸清了大鳞鲃在盐度、碱度胁迫下基因的表达情况,及大鳞鲃在盐度和碱度胁迫下的基因表达差异。其结果如下:将获得的clean reads拼接共得到204035个unigenes,这些基因可100%注释到7个数据库中(NR,NT,KO,PFAM,GO,Swiss Prot和KOG);其中NT数据库中注释基因数目最多(182388,占89.39%),KEGG数据库中注释到的基因数目最少(8859,占4.34%)。对比盐度、碱度胁迫下大鳞鲃脾脏基因表达差异,盐度胁迫下,共获得上调基因224个,下调基因有322个;而碱度胁迫下则获得上调基因有534个,下调基因有77个;此外,对比盐度、碱度胁迫下大鳞鲃脾脏组织差异基因表达GO聚类分析和KEGG聚类分析结果显示,盐度胁迫下,大鳞鲃脾脏组织的差异表达基因共富集到8个GO通路和9个相应的KEGG通路;而碱度胁迫下,大鳞鲃脾脏组织差异基因表达聚类分析则富集到14个GO通路和25个相应的KEGG通路;研究表明大鳞鲃应对盐度和碱度胁迫的调控机制和生存策略存在一定的差异。3、盐碱胁迫对大鳞鲃免疫相关基因表达的影响根据转录组测序结果,结合他人的研究,筛选了HSP70、HSP90、SOD、CAT、GPX1和GPX4 6个免疫相关差异表达基因,并检测分析了大鳞鲃5种组织(肝脏、肾脏、鳃、脾脏和皮肤)在12 g/L NaCl盐度和40 mmol/L Na HCO3碱度胁迫7个时间点(3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,96 h和7 d)6个基因的时空表达差异。研究结果显示:在盐度、碱度胁迫下,大鳞鲃肝、肾、鳃、脾和皮肤5种组织中HSP70、HSP90、GPX1、和GPX4 4个基因随着胁迫时间的延长,均呈现出先升高后降低的变化趋势,其表达量均在48 h内达到最高,并在胁迫7 d内基本恢复至对照组水平。而SOD和CAT基因在肝脏、肾脏、鳃和脾脏组织中均呈现出相同的变化趋势,但皮肤中SOD和CAT基因的表达量在整个胁迫过程中未出现显著性变化(P>0.05)。研究结果表明大鳞鲃能够适应12 g/L NaCl盐度环境和40 mmol/L Na HCO3碱度环境。
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