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丹参(Salviamiltiorrhiza Bunge),多年生药用草本植物,药用成分为根和根茎,主要有效成分为丹酚酸类和丹参酮类次生代谢产物,被用于治疗冠心病、脑血管疾病、神经退行性疾病、失眠和骨质流失等多种疾病。利用植物基因工程手段提高丹参中酚酸类或丹参酮类活性成分的含量是当前的研究热点。已知茉莉酸及其衍生物可有效提高丹参中次生代谢产物的含量,茉莉酸信号途径上的JAZ、MYC2等蛋白均参与次生代谢产物生物合成的调控。JAM(JASMONATE-ASSOCIATED MYC2-LIKE)蛋白属于 bHLH 转录因子家族的 Ⅲd亚家族,是响应茉莉酸甲酯的负调节因子。已知,拟南芥bHLH转录因子Ⅲd亚家族成员JAM1、JAM2、JAM3与Ⅲe亚家族成员MYC2、MYC3、MYC4拮抗调控茉莉酸诱导的下游生物学反应。东北红豆杉中,JAM蛋白TcJAMYC1,TcJAMYC2和TcJAMYC4负调控紫杉醇生物合成基因。在丹参中对JAM蛋白的研究未见报道,本实验从丹参中克隆获得了 bHLH转录因子Ⅲd亚家族基因SmbHLH53,对其次生代谢调控的功能进行了初步研究。本研究的主要内容与结果如下:1.基于课题组建立的丹参转录组和基因组数据库,通过PCR技术克隆得到bHLH类转录因子基因SmbHLH53,该基因全长为1799 bp,包含1个11 bp的内含子,cDNA长度为1788 bp,编码595个氨基酸残基。系统进化树分析表明,其属于Ⅲd亚家族,与拟南芥中的JAM1(bHLH17)相似度最高。PLANTCARE分析显示,其启动子区域包含光响应元件、胁迫应答元件、激素应答元件和蛋白结合元件。WOLFPSORT预测显示,SmbHLH53主要定位在核,其次在质膜上也有分布。Real-time PCR结果表明,SmbHLH53基因在叶和根中表达量最高,是外源ABA、机械伤害的快速响应基因。同时,在SmMYC2过表达株系中,SmbHLH53的表达量显著上调。2.利用GATEWAY技术构建SmbHLH53的亚细胞定位表达载体、酵母双杂交表达载体和双分子荧光互补(BiFC)表达载体。SmbHLH53亚细胞定位结果显示,该蛋白主要定位在核,在质膜也有分布,与生物信息学预测结果一致;酵母双杂交和BiFC实验结果显示,SmbHLH53蛋白可以形成同源二聚体,与JA信号途径上的SmJAZ1、SmJAZ3、SmJAZ8均能发生互作。3.运用GATEWAY技术构建SmbHLH53的过表达载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法获得了SmbHLH5 过表达丹参阳性株系。经分子水平检测,共筛选出5株SmbHLH53表达量显著上调的转基因株系:OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-6,其中,株系OE-1和OE-6的变化最为明显,SmbHLH53,的表达量分别是对照组的约22倍和14倍。4.过表达株系OE-1、OE-6总酚酸、总黄酮的含量测定结果显示,相比于对照株系,OE-1、OE-6中总酚酸含量显著提高,分别为对照组的1.29倍和1.28倍,总黄酮含量分别为对照组的2.02倍和1.14倍。通过LC-MS检测了转基因株系中次生代谢产物丹酚酸B、迷迭香酸、丹参酮ⅡA、隐丹参酮的含量变化:OE-1、OE-6中迷迭香酸含量分别为对照组的1.15倍和1.41倍,丹酚酸B含量OE-1、OE-6分别为对照组的1.08倍和1.39倍;丹参酮ⅡA、隐丹参酮含量均没有显著变化。5.对转基因株系OE-6和对照株系进行了转录组测序,结果发现OE-6株系差异表达基因(DEGs)一共有3420个,其中1672个基因表达量上调,剩余的1748个基因表达量下调。丹酚酸B合成通路上共有2个表达量显著上调的基因:SmRAS5和Sm4CL9,与对照株系相比SmRAS5上调约2.1倍,Sm4CL9上调约3.3倍,大多数其他基因的表达量仅有稍微的变化。丹参酮生物合成通路有3个表达量显著上调的差异表达基因:SmCPS2、SmGPPS2和SmGGPPS2,与对照株系相比,分别上调了 2.34倍、5.13倍和4.08倍,1个显著下调的基因SmDXS1,相比对照株系,其表达量下调了 2.55倍。本研究初步确定了丹参转录因子SmbHLH53对丹酚酸B和迷迭香酸积累的正调控作用,推测了其在丹参JA信号途径中与SmMYC2的关系,为提高药用植物丹参的活性成分提供了生物学基础。