瘤内低氧微环境在调节乳腺癌转移中起着关键作用。低氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）是响应低氧压力的主要调节因子。HIF-1α在缺氧条件下入核与靶基因启动子区的缺氧反应元件（Hypoxia response elements,HREs）结合,激活下游基因,促进肿瘤转移。因此,明确肿瘤缺氧与乳腺癌转移的关系,探究缺氧条件下HIF-1α的降解机制是转移性乳腺癌治疗领域亟待解决的关键科学问题。常氧条件下HIF-1α由脯氨酰羟化酶结构域酶（Prolyl hydroxylase,PHDs）羟基化,随后被泛素连接酶组分von Hippel Lindau（VHL）靶向降解。而在缺氧状态下,PHDs失去其羟化活性,此时一种蛋白翻译后修饰SUMOylation提供了另一个不依赖PHD的信号,促使HIF-1α与VHL结合并降解。SUMOylation是小泛素相关修饰蛋白（Small ubiquitin-related modifier protein,SUMO）对靶蛋白的结合性修饰,是一个动态过程,可以被Sentrin/SUMO特异性蛋白酶（SUMO Specific Peptidase,SENPs）逆转。其中SENP1从被修饰的HIF-1α中去除SUMO-1,对低氧状态下维持HIF-1α的稳定性发挥重要作用。SENP1在多种肿瘤中高表达,并与HIF途径驱动的肿瘤转移密切相关。研究表明,沉默SENP1能够减弱包括乳腺癌、肝癌及肾细胞癌等多种肿瘤细胞的转移能力。本课题组前期从事于乳腺癌抑制基因CLDN6的研究,高通量测序表明CLDN6可能是SENP1的一个潜在抑制分子。CLDN6是一个26 kDa的紧密连接（Tight junction,TJ）蛋白,羧基末端上的PDZ结合基序与细胞质TJ相关蛋白如ZO1、连环蛋白和钙粘蛋白相互作用,从而参与多种信号通路的调控。我们前期研究发现,CLDN6抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力,但其调控肿瘤转移的具体机制尚不清楚。进一步预实验结果显示,在低氧条件下乳腺癌细胞中CLDN6表达增加;生物信息学分析发现CLDN6启动子区域包含HIF-1α结合序列,推测在缺氧环境中HIF-1α转录上调CLDN6。瘤内缺氧是肿瘤转移的重要原因之一。因此,CLDN6在缺氧条件下的上调似乎是矛盾的。然而,CLDN6对SENP1的抑制作用支持我们提出的一种科学假设,即CLDN6通过一种负反馈机制参与了肿瘤细胞的低氧平衡反应。由此推测,缺氧环境下CLDN6由HIF-1α转录上调,随后通过抑制SENP1促进了HIF-1α蛋白降解,最终减弱缺氧诱导的乳腺癌转移。本研究旨在阐明CLDN6与肿瘤缺氧之间的联系,为明确CLDN6在缺氧环境下抑制乳腺癌转移进程中的作用提供科学依据,对以HIF-1α为靶点的转移性乳腺癌的治疗提供新的策略。方法:1.缺氧对乳腺癌细胞中CLDN6表达的调控作用及机制（1）缺氧对CLDN6表达的调控作用乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7及SkBr-3分别经低氧培养或化学缺氧模拟剂CoCl₂处理,RT-PCR和Western Blot检测CLDN6表达。（2）缺氧通过HIF-1α对CLDN6表达的调控作用使用HIF-1α敲减慢病毒转导MDA-MB-231细胞,低氧培养后Western Blot检测CLDN6表达;GCBI在线分析工具预测CLDN6的启动子区域存在潜在的HIF-1α结合序列;ChIP实验验证HIF-1α与CLDN6启动子区结合;荧光素酶报告基因实验检测HIF-1α对CLDN6转录活性的影响。2.CLDN6在HIF-1α诱导的乳腺癌迁移和侵袭的作用及机制（1）CLDN6对HIF-1α表达及转录活性的影响构建稳定过表达CLDN6的MDA-MB-231细胞系,mRNA seq及KEGG富集分析CLDN6的下游通路;RT-PCR及Western Blot检测过表达CLDN6后HIF-1α的表达;RT-PCR检测CLDN6对HIF-1α下游靶基因Glut1,EPO及SOX2表达的影响。（2）HIF-1α在CLDN6抑制细胞迁移和侵袭中的作用MDA-MB-231/CLDN6及SkBr-3/CLDN6中过表达HIF-1α,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力;Western Blot检测N-cadherin、Vimentin及E-cadherin的表达。（3）CLDN6调控HIF-1α的机制①PHD/VHL途径在CLDN6调控HIF-1α表达的作用:使用新生蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞,Western Blot检测不同时点的HIF-1α表达;使用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞,Western Blot检测HIF-1α表达;RT-PCR及Western Blot检测CLDN6对PHDs及VHL的表达的影响。②SENP1在CLDN6调控HIF-1α表达中的作用:RT-PCR及Western Blot检测MDA-MB-231/CLDN6、MCF-7/CLDN6及SkBr-3/CLDN6细胞中SENP1表达;正常人乳腺上皮细胞系HBL-100中敲低CLDN6后,RT-PCR及Western Blot检测SENP1表达;MDA-MB-231/CLDN6细胞中过表达SENP1,Western Blot检测缺氧环境下HIF-1α的表达;MDA-MB-231/CLDN6细胞中过表达SENP1,Western Blot检测全局蛋白SUMOylation水平,IP实验检测HIF-1α蛋白SUMO-1缀合水平;CLDN6表达质粒分别与HIF-1α^WT及HIF-1α^K391,K477R质粒共转染,Western Blot检测外源性HIF-1α的表达。③β-catenin在CLDN6调控SENP1表达中的作用:ChIP实验检测β-catenin蛋白与SENP1启动子区的结合;Western Blot检测MDA-MB-231/CLDN6细胞中β-catenin表达;MDA-MB-231/CLDN6细胞中过表达β-catenin,RT-PCR和Western Blot检测SENP1表达;Western Blot检测CHX处理细胞后CLDN6对β-catenin蛋白半衰期的影响;Co-IP检测CLDN6与β-catenin的结合;Duolink PLA实验观察CLDN6与β-catenin在细胞内的结合位置;Western Blot检测CLDN6对浆蛋白与核蛋白中β-catenin表达的影响。3.体内实验检测CLDN6/SENP1/HIF-1α对乳腺癌转移的影响28只雌性裸鼠分别经尾静脉注射MDA-MB-231/Vec,MDA-MB-231/CLDN6,MDA-MB-231/CLDN6+HIF-1α及MDA-MB-231/CLDN6+SENP1细胞悬液;注射4周后使用小动物活体成像装置观察肺部乳腺癌转移灶;采集裸鼠心包血,通过qPCR检测裸鼠外周血全基因组DNA;以人HK2/小鼠18sRNA的相对值分析裸鼠外周血循环肿瘤细胞数量;处死裸鼠后取出肺部,计数肺部转移瘤结节;石蜡包埋切片HE染色观察转移瘤所占面积。结果:1.缺氧对乳腺癌细胞CLDN6表达的影响及其机制（1）缺氧上调CLDN6的表达与对照组相比,低氧培养或CoCl₂处理均能显著增加CLDN6的mRNA及蛋白表达。（2）缺氧通过HIF-1α转录上调CLDN6的表达缺氧条件下敲低HIF-1α后,MDA-MB-231细胞CLDN6的蛋白表达显著低于对照组;ChIP实验显示,HIF-1α与CLDN6启动子区域的HRE序列结合;荧光酶报告实验结果显示,与对照组相比,缺氧或转染HIF-1α质粒组荧光活性升高。以上结果表明,缺氧通过HIF-1α在转录水平上调CLDN6的表达,CLDN6是HIF-1α的靶基因。2.CLDN6负反馈抑制HIF-1通路（1）CLDN6抑制HIF-1α及下游靶基因表达KEGG分析显示,过表达CLDN6引起差异基因富集于HIF-1通路上;MDA-MB-231及SkBr-3细胞中,过表达CLDN6显著抑制缺氧引起的HIF-1α蛋白表达,降低缺氧条件下HIF-1α下游靶基因Glut1、EPO及SOX2表达。（2）CLDN6通过下调HIF-1α抑制缺氧诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭与对照组相比,CLDN6过表达组细胞迁移率及侵袭细胞数显著降低,N-cadherin及Vimentin表达显著降低,E-cadherin表达明显增加;与MDA-MB-231/CLDN6细胞相比,过表达HIF-1α的MDA-MB-231/CLDN6细胞迁移率及侵袭细胞数显著增高,N-cadherin及Vimentin表达显著增加,E-cadherin表达明显降低。以上结果说明,CLDN6通过下调HIF-1α抑制缺氧诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭。（3）CLDN6抑制HIF-1α的机制①CLDN6独立于PHD/VHL途径促进HIF-1α降解:与对照组相比,CLDN6过表达组HIF-1α的mRNA水平无显著差异;CHX处理细胞,CLDN6过表达组HIF-1α的蛋白降解速度显著高于对照组;MG-132处理细胞后对照组与CLDN6过表达组中HIF-1α表达无统计学差异。提示,CLDN6通过泛素-蛋白酶体途径促进HIF-1α降解。对介导HIF-1α泛素途径降解的经典PHD/VHL通路检测发现,对照组与CLDN6过表达组中PHD/VHL通路蛋白的mRNA及蛋白水平无显著差异。以上结果提示,CLDN6对HIF-1α的调控作用可能由其他途径介导。②CLDN6通过抑制SENP1增加HIF-1α的SUMOylation:转录组测序分析发现,CLDN6抑制SENP1的表达;过表达CLDN6显著抑制SENP1的mRNA及蛋白表达,HBL-100细胞中敲低CLDN6,SENP1的mRNA及蛋白表达显著增加;CLDN6显著增加HIF-1α蛋白的SUMO-1缀合;MDA-MB-231/CLDN6细胞中过表达SENP1,HIF-1α蛋白表达显著升高,HIF-1α蛋白缀合的SUMO-1明显减少;CLDN6显著抑制HIF-1α^WT蛋白而非SUMO位点突变型HIF-1α^K391,477R蛋白的表达。以上结果表明,CLDN6通过SENP1增加了HIF-1α的SUMOylation水平。③CLDN6通过β-catenin抑制SENP1:ChIP实验表明,β-catenin与SENP1启动子区位点结合,提示β-catenin可能是SENP1的转录因子之一;MDA-MB-231细胞中,CLDN6显著下调β-catenin表达;MDA-MB-231/CLDN6细胞中过表达β-catenin显著增加SENP1的表达;CHX处理细胞,CLDN6过表达组β-catenin的蛋白半衰期显著低于对照组;Co-IP实验显示,MDA-MB-231/CLDN6中CLDN6与β-catenin相互结合;与对照组相比,CLDN6过表达组细胞浆蛋白中β-catenin的表达水平无统计学差异,而核蛋白中β-catenin表达水平显著减少。以上结果提示,CLDN6通过抑制β-catenin核转位,进而下调β-catenin下游靶基因SENP1的表达。3.体内实验检测CLDN6/SENP1/HIF-1α对乳腺癌转移的影响与对照组相比,CLDN6组裸鼠肺部的转移灶明显减少,外周血循环肿瘤细胞数量显著,肺部转移灶数量及面积显著减少;CLDN6+HIF-1α及CLDN6+SENP1组裸鼠的肺部荧光值、外周血循环肿瘤细胞数量、肺部转移灶数量及面积均显著高于CLDN6组。以上结果说明,CLDN6通过SENP1/HIF-1α轴抑制乳腺癌转移。结论:1.紧密连接蛋白CLDN6可能是HIF-1α的直接靶基因。2.缺氧条件下CLDN6与HIF-1α之间存在之前未被识别的负反馈机制。3.CLDN6通过调控HIF-1α蛋白SUMOylation减弱缺氧诱导的乳腺癌转移。