氮离子注入酵母菌KH8的生物学效应

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离子束注入生物体具有其独特的辐射诱变机理,因此使其可以介导远缘超远缘DNA(脱氧核糖核酸)分子在受体菌中获得转化。在此研究背景下,本文前期采用N~+(氮离子)注入介导甘草基因组DNA在季也蒙假丝酵母菌KH8中进行随机转化研究,利用薄层色谱检测到转基因重组菌6076产生一种新的红色代谢产物,确定其代谢途径在N~+注入介导转基因的过程中发生了改变。为了揭示重组菌6076中红色物质产生的分子机理,本文以该菌株和原始出发菌株为研究材料,采用荧光双向电泳和抑制差减杂交对基因重组菌进行蛋白质组学和差异表达基因进行初步研究。荧光双向电泳结合质谱分析的结果鉴定分析了重组菌株6076在产生红色物质时蛋白质组相对于出发菌株的变化,在突变菌株中共检测到蛋白质表达量变化的差异点56个,其中表达量上调的蛋白质点26个,下调的蛋白质点30个。将鉴定出的56个差异蛋白质在数据库中进行功能检索,即通过质谱仪和串联的质谱质量光谱测定法(质谱分析法)进行鉴定,其蛋白质的功能主要涉及碳水化合物和能量代谢过程、蛋白质代谢、细胞信号传递、核苷酸生物合成和救助以及压力响应,其中还有部分蛋白质的功能是未知的。在表达量下调蛋白质点中,编号为273、1249、1294和1347蛋白质可信度指数分别为81.371%、99.563%、12.864%和99.986%。其中编号为273和1294的蛋白质可信度指数低于85%,推测是由于氮离子注入介导转基因导致这两个蛋白质产生了突变。此外,利用抑制差减杂交技术构建了重组酵母6076和出发菌株KH8的差减文库,在重组菌6076的正向差减文库中,即存在构建差减的互补脱氧核糖核酸文库,测序获得14条不同的差异表达基因序列,为9个差异表达基因,其中有7条序列碱基发生了突变。在7条差异表达基因片段中有4条基因片段由于碱基的突变导致了其蛋白质序列的变化,其中1条序列有碱基的缺失,氨基酸预测蛋白质序列同源比对后,功能未知,并且有一种向前的差减互补脱氧核糖核酸文库。而在出发酵母KH8中高表达的差减文库中获得10条差异表达基因序列。在获得的6076转基因酵母高表达基因片段中,分离了多个与生物信息转录、翻译相关的基因,这表明转基因酵母培养96小时后,遗传信息的转录、翻译过程仍比较活跃。本研究从蛋白质组学和差异表达基因的角度研究了氮离子注入酵母菌KH8的生物学效应,取得了阶段性的研究结果,获得了一些重要的结论,但实验所鉴定的差异表达蛋白质以及差异表达基因与红色物质的代谢关系还有待进一步研究。
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