目的异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是目前治愈恶性血液系统疾病最有效的手段之一。移植物抗肿瘤（GVT）效应是allo-HSCT后供者免疫细胞清除肿瘤细胞和防止复发的主要机制。GVHD和GVT作用常同时存在,在一些减轻GVHD的治疗方法影响下,GVT作用也被削弱。间充质干细胞（MSC）和造血干细胞（HSC）联合移植能够改善造血微环境促进造血干细胞的植入,发挥有效的免疫抑制作用,减轻GVHD。本研究利用纯系小鼠C57BL/6H-2b→BALB/cH-2d建立MHC不相合造血干细胞移植荷瘤动物模型,将封闭群KM小鼠骨髓MSC经体外培养后与供鼠的脾脏及骨髓细胞进行联合移植,探讨第三者来源的MSC在促进MHC不相合HSCT后的造血重建、诱导免疫耐受同时,对GVT作用的影响。方法1实验动物清洁级造血干细胞供鼠C57BL/6^H-2b（B6）,6⁸周龄,雌雄兼用;受鼠BALB/c^H-2d,6⁸周龄,雌雄兼用;第三者BMMSC供鼠,KM小鼠,6⁸周龄,雌雄兼用。以上动物由河北省实验动物中心提供,合格证编号为803177。饲养于百级层流洁净动物饲养柜。2 BMMSCs的培养、扩增将BMMSCs供鼠颈椎脱臼处死,无菌分离小鼠股骨及胫骨,以含F12-DMEM为完全培养基（CCM,含青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml、HEPES液0.03mol/L以及20%FBS）冲出骨髓。直接接种于25cm²一次性无菌塑料培养瓶中,37℃,5%CO₂饱和湿度培养,每48小时半量换液一次,换液两次后,改为3-4天全量换液。当贴壁细胞层达到90%以上融合时,以0.25%胰酶消化,传至第3代以后的细胞,纯度>90%用于移植。3制备小鼠脾脏（SPC）及骨髓细胞（BMC）取B6小鼠脱颈椎处死后,无菌分离脾脏、双侧股骨和胫骨。常规制备SPC及BMC悬液,锥虫蓝计数,拒染率>95%,调整至所需细胞浓度备用。4 B16细胞的体内传代小鼠黑色素细胞瘤B16购于河北医科大学实验动物学部。常规培养传代后,制备1×10⁷/ml细胞悬液,接种于BALB/c小鼠右前腋下,每鼠约1×10⁶细胞,在移植当天无菌条件下取出肿瘤块,并制得单细胞悬液,锥虫蓝计数,拒染率>95%;调整细胞浓度至1×10⁷/ml备用。5 MHC不相合造血干细胞移植荷瘤动物模型的建立供受鼠均于移植前3天开始饮用酸化水。将研磨制得的小鼠B16细胞接种于受鼠BALB/c右前腋下,0.1ml/鼠（1×10⁶细胞）,24小时后接受⁶⁰Coγ射线亚致死性全身照射（TBI）8.5Gy,剂量率0.63Gy/min,预处理后4小时内接受（BMC 5×10⁶+SPC 1×10⁷）_B6/0.2ml/鼠,实验组同时输注不同数量的BMMSC_KM/B6 ,对照组输注生理盐水/0.2ml/鼠。6动物分组a.低数量第三者MSC移植组: B16+TBI+（BMC+SPC）_B6+BMMSCKM（5×10³）→BALB/cb.中数量第三者MSC移植组: B16+TBI+（BMC+SPC）_B6+BMMSCKM（5×10⁴）→BALB/cc.高数量第三者MSC移植组: B16+TBI+（BMC+SPC）_B6+BMMSCKM（5×10⁵）→BALB/cd.高数量供鼠MSC移植对照组: B16+TBI+（BMC+SPC）_B6+BMMSC_B6（5×10⁵）→BALB/ce.无MSC移植组: B16+TBI +（BMC+SPC）_B6→BALB/cf.单纯TBI对照组: TBI→BALB/cg.TBI+B16对照组: B16+TBI→BALB/ch.B16成瘤对照组: B16→BALB/c注:每组动物4～5只（不包括在移植后不同时间活杀,留取标本的动物）,每组实验重复2次。7结果判断标准7.1移植失败:动物死亡时WBC≤1×10⁹/L,或者移植15天后WBC≤1.5×10⁹/L。7.2 GVHD判断:WBC>1.0×10⁹/L并伴有以下症状3种以上的动物定为GVHD:精神萎靡,翘毛,脱毛,皮损,腹泻,弓背,眼炎,体重骤减甚至死亡; d+10天内出现症状者为超急性GVHD（saGVHD）;d+10～d+30天出现者为aGVHD。7.3肿瘤导致死亡的判断:动物死亡时WBC>1.5×109/L,肿瘤明显增大,破溃坏死,无明显GVHD表现。7.4长期生存:生存时间大于30天记为长期生存。若生存期大于60天按60天计算。8移植动物观察内容移植后每天观察小鼠进食及精神的状况,有无aGVHD的表现;每天称量体重;可触及的肿瘤出现为肿瘤出现时间,每隔3天用游标卡尺测量肿瘤大小;记录小鼠的存活时间及原因。隔日采集小鼠尾静脉血,计数WBC数。择时取小鼠的肺、肝、小肠进行病理学检查,并观察变化和差异。9统计学分析采用SPSS13.0统计软件包处理,实验数据采用X士SD表示,多个样本两两比较采用q检验（SNK法）, P<0.05为有统计学差异。绘制Kaplan-Meier生存曲线。结果1 BMMSC对造血重建的影响各移植组植入率均为100%（40/40）。a、b、c、d、e、f各组外周血白细胞均于+4d内达最低,造血重建时间依次为6.0±0.76d,5.3±0.64d,4.9±0.6d,5.0±0.53d,6.7±0.74d,12.0±1.31d。b、c、d组与e组比较造血重建时间明显缩短（p<0.05）;a组与e组比较,造血重建时间没有显著差异（p>0.05）。a、b、c组造血重建时间随BMMSC输注数量的增多,时间依次缩短,各组之间比较均有显著差异（p<0.05）;c组与d组造血恢复时间无明显差异（p>0.05）;在观察期内f组外周血WBC达最低点后缓慢回升,并可长期生存,但WBC始终低于正常。2 BMMSC对GVHD发生情况的影响2.1各组体重变化a、b、c、d各移植组体重于d+7左右达到最低水平,之后随着造血的重建,GVHD和肿瘤生长共同作用下,体重变化呈异质性。f和g组体重均于d+10左右达到最低,但f组体重缓慢恢复,并获得长生存;g组体重则随肿瘤体积的增大恢复较快,超过其他各组的增长速度,但很快衰竭死亡;h组体重随肿瘤生长持续增长,直至死亡。2.2 aGVHD一般情况观察a、b、c、d、e组出现aGVHD的时间依次为7.00±1.07d,12.6±1.06d,14.75±1.28d,14.63±0.92d,5.88±0.83d;a、b、c、d组与e组比较,aGVHD出现的时间推迟,病变程度减轻（p<0.05）;随BMMSC输注数量的增加,a、b、c组aGVHD出现的时间推迟,病变程度依次减轻,各组之间比较均有显著差异（p<0.05）;c组和d组小鼠移植早期仅有轻度脱毛和体重减轻,精神状态良好,aGVHD发生时间最晚,两组发病时间基本一致（p>0.05）。2.3 BMMSC对aGVHD后肺、肝、小肠病理情况的影响各组GVHD发生时基本病理变化一致。a组和e组病变程度最严重:肺组织明显充血,肺泡腔出血;肝细胞水肿并伴有大片灶性坏死,汇管区及中央静脉和肝血窦明显扩张、淤血,并伴有炎性细胞浸润;小肠腺体及局部粘膜上皮坏死,肠腔内有大量脱落的坏死上皮细胞。b、c、d各组病变程度则明显减轻,其各组间无明显差别。3 BMMSC对小鼠移植后肿瘤生长的影响a组和e组小鼠因移植后很快出现较重的GVHD而死亡,未形成瘤块。b、c、d、g、h各组肿瘤出现时间依次为9.00±0.53d,8.50±0.93d,8.75±0.71d,7.63 d±1.06d,6.38 d±0.92d。d+15测量各组肿瘤大小依次为0.235±0.070 cm3,0.312±0.041 cm3,0.299±0.038 cm3,2.543±0.233 cm3,2.132±0.239 cm3。b、c、d各组小鼠肿瘤出现时间比较无显著差别;d+15肿瘤大小虽随着BMMSC输注数量的增加,肿瘤稍有增大的趋势,但均明显小于g组,各组间比较无显著差别（p>0.05）。说明移植后发生了GVT作用,且BMMSC的输注对GVT没有显著抑制作用。c组和d组肿瘤出现的时间和大小比较无明显区别,p>0.05;提示第三者小鼠BMMSC和供者来源BMMSC对GVT的影响作用无显著差别。4 BM MSC对小鼠生存情况影响a-h组各组生存时间依次为9.13±0.99d,18.25±1.39d,27.13±3.18d , 26.25±2.60d , 8.25±0.89d , 39.00±2.73d ,17.16±0.98d,36.88±2.90d,移植组小鼠最终均死于GVHD。a组与e组存活时间存活时间无差别;b、c、d各组生存时间较e组明显延长p<0.05。c组与b组比较生存时间延长,p<0.05;提示BMMSC延长小鼠生存时间,且作用效果与BMMSC移植数量正相关;c组与d组生存时间比较,p>0.05,即第三者BMMSC移植组小鼠和供者BMMSC移植组生存时间无明显差别。结论1供者及第三者来源的BMMSC均可促进MHC不相合HSCT后造血重建,作用的效果与BMMSC数量有关但与BMMSC来源无关。2供者及第三者来源的BMMSC均可减轻MHC不相合HSCT后的aGVHD反应,延长生存时间,其作用效果与BMMSC数量有关,与BMMSC来源无关。3供者及第三者BMMSC在减轻MHC不相合HSCT后aGVHD的同时,对GVT的抑制作用不明显。