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目的基于肝纤维化时血管新生的病理机制,以肝纤维化不同时期的肝窦内皮细胞(SEC)与VEGF过表达的肝星状细胞(HSC)共培养为实验材料,探讨疏肝健脾方含药血清对VEGF调控的抗肝纤维化机制,并确定该方的最佳干预时相。方法1.分离正常大鼠HSC及SEC,大鼠皮下注射CCl4制备肝纤维化模型,分别于造模的第2w、4w、8w分离模型大鼠SEC;2.针对大鼠VEGF基因构建sh RNA重组慢病毒,转染体外培养的HSC,共聚焦显微镜检测转染后HSC绿色荧光蛋白表达、免疫印迹蛋白(Western Blot)检测VEGF蛋白表达;3.中浓度疏肝健脾活血方行大鼠灌胃制备含药血清,得到含药血清后配置为不同浓度的含药血清培养基作用于HSC,MTT法检测不同浓度的疏肝健脾活血方含药血清对HSC增殖的影响,确定含药血清最佳有效浓度;4.分别取2w、4w、8w三个时间点分离得到的正常大鼠HSC和SEC、肝纤维化模型大鼠SEC、转染得到的VEGF过表达HSC分为如下6组:H组:正常大鼠HSC完全培养基培养;HS组:正常大鼠HSC和正常大鼠SEC完全培养基共培养;HM组:正常大鼠HSC和模型大鼠SEC完全培养基共培养;VM组:VEGF过表达HSC和模型大鼠SEC完全培养基共培养;HMZ组:正常大鼠HSC和模型大鼠SEC 10%含药血清培养基共培养;VMZ组:VEGF过表达HSC和模型大鼠SEC 10%含药血清培养基共培养。共18组;5.Western Blot测定HSC中胶原IV、VEGF、VEGFR-2和SEC中CD31、v WF蛋白的表达水平;采用逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测HSC中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 m RNA的相对表达量。结果1.10%含药血清抑制效果最佳;2.模型SEC与HSC共培养后刺激HSC增殖,VEGF过表达下促进增殖(P<0.01);3.2w起相较于H组和HS组,VM组SEC中CD31和v WF的蛋白表达上调(P<0.01),持续至8w;共培养下HSC中胶原IV、VEGF、VEGFR-2蛋白表达上调,VEGF m RNA表达上调(P<0.05或P<0.01);4.相较于H组和HS组,HM组SEC中CD31和v WF的蛋白表达有所上调(P<0.05或P<0.01),共培养下HSC中胶原IV、VEGF、VEGFR-2蛋白表达上调(P<0.05或P<0.01),VEGF m RNA表达升高(P<0.05或P<0.01);与HM组比较,HMZ组SEC中CD31和v WF蛋白表达有所下调(P<0.05或P<0.01),4w时共培养HSC胶原IV、VEGF、VEGFR-2蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01),VEGF m RNA表达降低(P<0.01)。结论10%含药血清培养基抑制HSC增殖的作用最为显著;肝纤维化模型SEC促进HSC增殖,在VEGF刺激下增殖作用加强,在疏肝健脾活血方的作用下增殖被有效抑制;肝纤维早期(2w)VEGF过表达促进SEC失窗孔化,可能是通过与VEGFR-2结合引起的;疏肝健脾活血方在肝纤维早期(2w及4w)能逆转SEC失窗孔化,其机制可能与下调VEGF、VEGFR-2的表达有关。