论文部分内容阅读
目的：本实验拟通过对乳腺癌患者的癌组织进行体外细胞培养，探讨乳腺癌细胞中热休克蛋白70（heat shock protein70,HSP70)与Her复合物的分离纯化方法，为后续分析建谱，明确乳腺癌组织肿瘤细胞HSP70-Her肿瘤肽的表达情况，通过人工干预自体HSP70-Her复合物减弱或消除肿瘤患者免疫耐受，增强自体肿瘤抗原性的个体化生物治疗方案做准备工作。 方法：选取32例符合条件的患者作为志愿者，在无菌条件下将留取的癌组织放入盛有无菌乳腺癌洗涤液的50ml离心管中，使乳腺癌组织标本完全浸入洗涤液中。后在超净工作台中对癌组织进行初步处理以除去组织周围的脂肪组织并剪碎。对已处理的组织进行消化，完成消化后进行细胞计数，根据所得的细胞数将乳腺癌细胞接种于相应的细胞培养板或细胞培养瓶中，加入培养液使细胞均匀的悬浮于培养液中，置入37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行培养。每日观察细胞的生长状况，定期换液，当细胞生长到一定数量时进行细胞传代，当细胞数达到后续实验所需时选择生长状态较好的细胞（余细胞冻存）进行热休克（42℃）处理，再用裂解液裂解、超声破碎、高速离心、ConA Sepharose亲和层析结合ADP agarose亲和层析方法分离纯化，通过SDS-PAGE电泳验证为HSP70-Her复合物。 结果：(1)细胞原代培养24小时后，显微镜下观察可见大部分细胞呈贴壁状态，少量细胞仍悬浮于培养液中，不能贴壁。培养48小时后，镜下观察细胞基本全部呈贴壁生长。（2）当肿瘤细胞培养至9-10天，传代至第三代后，细胞生长旺盛，迅速生长，镜下观察细胞形态良好且细胞数大量增加，当细胞增殖达到一定数量后对细胞进行冻存。（3）乳腺癌细胞经裂解液裂解、超声破碎、高速离心、ConA Sepharose亲和层析结合ADP agarose亲和层析方法分离纯化后通过电泳验证可知Her与HSP70在细胞中以复合物的形式存在。 结论：乳腺癌细胞可以进行体外培养增殖及冻存，并经过SDS-PAGE电泳验证可知在对体外培养的人乳腺癌细胞进行热休克处理后用裂解液裂解、超声破碎、高速离心、ConA Sepharose亲和层析结合ADP agarose亲和层析及的方法可获得相对纯度较高的HSP70/Her复合物，为后续分析建谱，通过人工干预自体HSP70-HER复合物减弱或消除肿瘤患者免疫耐受，增强自体肿瘤抗原性的个体化生物治疗方案做准备工作。