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葡萄是世界范围内重要的栽培果树之一,尤其是欧洲葡萄,品质优良,具有很高的经济价值,但是抗病性较差。中国是葡萄起源中心之一,拥有大量野生葡萄种质资源。本研究以课题组前期获得的抗病性强,而且在成熟果实中白藜芦醇含量高的中国野生毛葡萄‘丹凤-2’和欧洲葡萄赤霞珠果实不同发育时期转录组数据为基础,以‘丹凤-2’为研究材料,通过接种葡萄白粉菌,筛选出响应白粉菌诱导并且与芪合成酶基因共表达的转录因子VqERF112、VqERF114和VqERF072。研究3个ERF转录因子调控抗病相关基因的表达,主要研究结果如下:1、通过同源克隆获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中3个ERF转录因子基因VqERF112、VqERF114和VqERF072并进行功能分析,发现它们的序列全长分别为717bp、1266 bp和645 bp,分别编码238、421和214个氨基酸;这3个ERF转录因子均含有1个AP2/ERF保守结构域,属于ERF亚族,分别定位于第1、18和15号染色体,与欧洲葡萄中同源基因的氨基酸序列相似度分别为99.58%、99.05%和98.13%;3个ERF转录因子基因响应葡萄白粉菌诱导,以及外源激素乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸诱导,VqERF112和VqERF072响应赤霉素诱导,但VqERF114不响应赤霉素;组织特异性表达分析发现,VqERF112和VqERF114在成熟果中表达量最高,VqERF072在卷须中表达量最高;VqERF112在细胞核、细胞质和细胞膜中均有分布,VqERF114和VqERF072定位于细胞核中;3个转录因子均具有酵母中转录自激活活性。2、通过同源克隆获得‘丹凤-2’和无核白中ERF112、ERF114和ERF072基因启动子并进行功能分析,发现在两种葡萄中启动子序列顺式作用元件差异主要包括防御胁迫相关TC-rich repeats、响应乙烯的ERE、响应水杨酸的TCA-element和响应茉莉酸甲酯的TGACG-motif。构建启动子融合GUS蛋白表达载体,瞬时转化无核白叶片后,进行葡萄白粉菌接种处理及外源激素乙烯、水杨酸和茉莉酸甲酯诱导处理,GUS活性分析结果表明,VqERF112、VqERF114和VqERF072启动子均响应白粉菌及外源激素乙烯、水杨酸和茉莉酸甲酯诱导。3、对3个ERF转录因子进行调控抗病功能研究,发现VqERF112、VqERF114和VqERF072响应丁香假单胞菌和灰霉菌诱导,构建这3个ERF转录因子过量表达载体,转化拟南芥,对转基因株系进行病原菌接种处理。接种丁香假单胞菌后,与野生型相比,转基因株系叶片没有明显黄化,单位叶面积的细菌数目(约为10~4 cfu/cm~2)低于野生型(约为10~6 cfu/cm~2),叶片细胞死亡和过氧化氢积累更多,对丁香假单胞菌的抗性增强;响应水杨酸信号抗病相关基因AtNPR1和AtPR1的表达量增加,而AtICS1和AtPR5的表达受到抑制,响应茉莉酸/乙烯信号抗病相关基因AtPDF1.2、AtLOX3、AtPR3和AtPR4的表达量均有增加。接种灰霉菌后,与野生型相比,转基因株系叶片发病状况更轻,病斑直径更小,有更少的叶片细胞死亡和过氧化氢积累,对灰霉菌的抗性增强;响应水杨酸信号抗病相关基因AtNPR1、AtPR1和AtICS1的表达量增加,而AtPR5的表达受到抑制,响应茉莉酸/乙烯信号抗病相关基因AtPDF1.2、AtLOX3、AtPR3和AtPR4的表达量均有增加。4、对VqERF114进行调控芪合成酶基因表达研究,发现VqERF114在‘丹凤-2’叶片中瞬时过量表达后,芪合成酶基因表达量升高10.9倍,芪类物质反式-白藜芦醇和反式-云杉新苷的含量分别增加1.6和1.7倍。VqERF114特异结合GCC-box顺式作用元件,对13条芪合成酶家族基因启动子序列进行顺式作用元件分析,没有发现GCC-box元件,而是含有MYB转录因子结合的MRE或MBS元件。通过酵母双杂交筛选到与VqERF114互作的转录因子VqMYB35,双分子荧光互补验证其互作关系。双荧光素酶试验、酵母单杂交和实时荧光定量PCR分析发现,VqMYB35通过结合启动子中MBS元件,促进启动子活性,增强芪合成酶基因VqSTS15、VqSTS28、VqSTS42和VqSTS46表达。共同过量表达VqERF114和VqMYB35,能够更显著促进VqSTS15、VqSTS28、VqSTS42和VqSTS46表达,以及产物芪类物质反式-白藜芦醇和反式-云杉新苷合成。对‘丹凤-2’中MYB转录因子VqMYB35进行基因克隆和功能分析,发现VqMYB35基因序列全长1113 bp,编码370个氨基酸,定位于第14号染色体,具有2个保守的SANT结构域,属于R2R3-MYB转录因子;VqMYB35能够响应葡萄白粉菌诱导,以及外源激素乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸诱导;组织特异性表达分析发现VqMYB35在成熟叶中表达量最高;转录因子VqMYB35定位于细胞核,并且具有酵母中的转录自激活活性。综上,中国野生毛葡萄ERF转录因子VqERF112、VqERF114和VqERF072通过调控响应水杨酸和茉莉酸/乙烯信号抗病相关基因表达,正向调控对丁香假单胞菌和灰霉菌的抗性;VqERF114通过与VqMYB35互作,调控芪合成酶基因表达和芪类物质合成。