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大豆是人和动物的营养中最重要和使用最广泛的植物蛋白原料。大豆加工副产品豆粕是全世界动物饲料中使用最多的蛋白原料。大豆中的两种贮藏蛋白—大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白占大豆总蛋白的70%左右,由于大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量高,使其成为影响大豆及其蛋白产品功能特点的重要因素。因此,大豆球蛋白和大豆伴球蛋白的分子结构和功能的关系成为广泛研究的问题。为了阐明加工过程大豆蛋白的结构变化对抗原蛋白免疫活性和消化率等营养价值的影响,本文采用了红外光谱、差热扫描和扫描电镜等技术对蛋白质的分子结构进行研究,并对提取的结构数据与免疫活性和消化率进行相关分析,以揭示加工过程大豆蛋白的结构特征与营养价值的关系。1.针对120℃干热和湿热处理的纯化固体大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白样品,本文采用红外光谱、差热扫描和扫描电镜等技术对其分子结构进行分析。DSC结果表明大豆球蛋白比β-伴大豆球蛋白的超分子结构更复杂,含更高的能值,并且大豆球蛋白柔性较低;扫描电镜结果显示:120℃湿热处理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋比120℃干热处理大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白具有更强的聚集状态,而分子聚集不利于蛋白质的消化与吸收;红外光谱峰强变化数据显示:120℃湿热处理的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的峰强出现显著性变化(P<0.05),表明120℃湿热处理引起大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白结构显著变化;红外光谱酰胺Ⅰ带解析结果显示120℃湿热处理引起大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分子内聚集A1向分子间聚集A2转变,β-折叠显著下降(P<0.05),α-螺旋和无规卷曲显著增加(P<0.05);120℃干热处理引起β-伴大豆球蛋白β-折叠显著下降(P<0.05)和β-转角显著增加(P<0.05),而对大豆球蛋白的二级结构没有显著变化,表明大豆球蛋白比β-伴大豆球蛋白结构热稳定性更好,结构不易破坏。2.利用Native-PAGE电泳、荧光光谱和红外光谱方法对热处理溶液中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的分子结构进行分析,运用ELISA检测其相应的免疫活性变化。Native-PAGE电泳结果显示随温度升高天然结构大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白减少同时聚集体增加,表明随温度升高疏水基团暴露增加分子聚集;荧光光谱结果同样检测到加热引起的疏水环境升高引起的热聚集。红外光谱酰胺Ⅰ带的去卷积峰位向低波数位移,表明加热处理引起的氢键作用变强,这对消化吸收是不利的。ELISA结果显示大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的β-折叠与免疫活性呈显著正相关(r=0.897,r=0.886),而无规卷曲与免疫活性呈显著负相关(r=-0.937,r=-0.714),表明热变性引起的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白构象变化显著影响其免疫活性的变化。3.采用TNBS、ELISA、Tricine-SDS-PAGE和SDS-PAGE检测不同蛋白酶酶解大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白产物的水解度、免疫活性和分子量变化,运用扫描电镜、差式量热扫描和红外光谱等技术分析蛋白酶解产物的结构变化。Tricine-SDS-PAGE结果显示大豆球蛋白酶解后的亚基含量变化,表明酸性亚基比碱性亚基更容易水解,SDS-PAGE结果显示酶解后β-伴大豆球蛋白的β-亚基最难降解;大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的水解度与其相应的免疫活性呈极显著负相关(P<0.0001),线性回归结果表明可以通过水解度预测蛋白质的免疫活性变化;扫描电镜显示大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白酶解产物原有的聚集结构消失和疏松程度增多,这是对消化有意义的变化;胃蛋白酶、黑曲霉酸性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶120min酶解大豆球蛋白产物的二级结构中β-折叠显著降低(P<0.05),表明分子由有序结构变得无序;三种蛋白酶对β-伴大豆球蛋白酶解产物β-折叠均呈现升高变化,这意味着不利于进一步酶解。4.利用红外光谱分析六种不同大豆蛋白的结构特征,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法测定不同大豆蛋白的体外消化率。对不同大豆蛋白红外光谱数据进行主成分分析和聚类分析,不同大豆蛋白红外光谱的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的峰面积、拟合二级结构α-螺旋和β-折叠、酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰面积比值结果呈显著差异(P<0.05),表明红外光谱结构数据可以有效区分不同大豆蛋白。斯皮尔曼相关分析显示酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比值和体外消化率呈显著负相关(P<0.01),酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰面积比值和体外消化率呈显著负相关(P<0.01);二级结构β-折叠与体外消化率呈显著负相关(P<0.05);表明不同大豆蛋白的结构特征显著影响蛋白质的消化,中红外光谱产生的结构特征数据与大豆蛋白的营养成分和消化性的关系可以直接反映蛋白质的营养价值与消化利用价值。总之,基于中红外光谱的实验数据没有破坏饲料或纯蛋白质内在结构如α-螺旋、β-折叠、无规卷曲和β-转角的比例和平衡,这些蛋白质的结构特征影响着蛋白质的营养品质和动物的消化利用。红外光谱数据显示了不同饲料蛋白原料真实的内在结构特征,为分析蛋白质的结构变化提供了科学依据,在饲料蛋白检测应用中具有广阔的发展前景。