脂多糖(LPS)又称内毒素,是革兰氏阴性细菌引起宿主炎症反应的主要物质,常被用于建立系统性炎症模型。系统性炎症反应是常见的病理过程,过度的炎症反应会引起严重的器官功能衰竭,因此研究炎症反应中免疫系统的作用机制对防控感染性疾病具有指导作用。大量研究证明,免疫系统与神经内分泌系统组成了神经-内分泌-免疫网络,协调维护机体的稳态,其中下丘脑-垂体系统是调节神经内分泌反应的核心系统,该系统整合了神经-内分泌功能,参与多种生物学过程。下丘脑室旁核(PVN)中大量神经元的轴突投射至垂体后叶,控制垂体的激素分泌。系统地研究PVN和垂体在炎症反应过程中翻译组水平的基因表达变化,对于揭示神经内分泌系统在炎症反应中发挥的作用具有重要意义。翻译调控对蛋白质丰度的影响占所有调控的54%,因此研究翻译组学,能够帮助人们更好地理解各类生理调控过程。本研究旨在开发一套可以用于分析翻译组信息的工具,并利用该工具分别对LPS引起的炎症反应过程中小鼠PVN及垂体翻译组水平的基因表达差异作研究和分析。本课题研究内容主要包括以下几个方面:1. 构建初代r AAV-TRAP系统,在细胞水平验证该套系统的可行性。 实验初期尝试核糖体亲和纯化技术(TRAP)结合核糖体分析技术(Ribo-seq),用足迹化的m RNA片段构建c DNA文库。但这种方法需初始细胞量至少达到7.5×10~6个,无法满足活体动物实验。因此决定采用传统的SMART建库法,这种方法利用全长m RNA构建c DNA文库。通过实验证明SMART建库法可将细胞初始量降至2×10~3个,满足活体动物实验要求。2. 构建第二代r AAV-m APP-TRAP系统。在细胞水平验证了TRAP可以成功纯化出正在翻译的m RNA,并确定了构建寡量细胞c DNA文库的方法。随后对初代的r AAV-TRAP系统进行了适当的改造,在保证TRAP系统功能的前提下在融合蛋白Fc NBL10的N端添加了一段含有突触前膜蛋白序列的m APP序列,通过这段序列,可以将TRAP系统经PVN定位至垂体,借助此系统可分析PVN和垂体中的翻译组信息。3. 提取PVN和垂体组织样品,构建翻译组文库,并分析数据。通过小鼠脑组织震荡切片观察荧光情况,证明r AAV-m APP-TRAP可以在小鼠体内成功表达。随后对LPS处理小鼠PVN及垂体的翻译组基因表达差异作了分析。LPS处理使PVN和垂体都激活了大量与炎症相关的内分泌通路:PVN中激活了催产素信号通路、甲状腺激素信号通路、胰高血糖素信号通路和雌激素信号通路,上调表达了催产素(PRL)等激素以及IL-1β和TNFα等细胞因子;垂体中激活了甲状腺激素合成通路、催产素信号通路、促性腺激素释放激素信号通路、皮质醇合成通路和催乳素信号通路,上调表达了催产素(PRL)、促甲状腺激素释放激素(TRH)和IL-17等免疫相关物质。在PVN和垂体中共同激活的其他与炎症相关的通路还包括昼夜节律、产热、脂肪代谢等通路。本研究利用翻译组学技术对LPS引起的炎症反应中PVN及垂体的翻译组信息作分析,有助于了解PVN和垂体在细菌引起的炎症反应中发挥的对内分泌、免疫过程的调节作用,并为防治细菌性炎症反应提供理论基础。