金霉素(Ch Iortetracycline)属于广谱抗生素，它是从土壤微生物——金黄色链霉菌中（Streptomyces aureofaciens）分离出来，是四环素类抗生素家族第一个被发现的成员。该家族抗生素通过与细菌核糖体30S小亚基的氨酰-tRNA位点（A位点）的特异性结合，阻止肽链的延伸，抑制细菌蛋白质的合成，从而发挥抗菌作用。由于抗菌谱广，治疗感染等疾病效果显著，四环素类抗生素在临床上取得了巨大的成功。加上四环素类抗生素具有独特的化学结构和抗菌机制，一直到现在，科学家们依然对其保持着浓厚的研究兴趣。四环素类抗生素的研究已经涵括了生物化学、微生物学、结构生物学、合成化学、合成生物学和细胞生物学等多个学科。　　早期关于四环素类抗生素生物合成机制的研究，主要集中在金黄色链霉菌一些随机突变株产生的中间体上。但是由于遗传操作瓶颈，四环素类生物合成的机制，特别是一些关键步骤，并没有非常明确的结论。最近几年，UCLA唐奕小组通过异源表达和体外生化实验，报道了龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）所产土霉素的生物合成的研究，包括起始单元和后修饰中的几步氧化反应，人们逐渐了解了四环素类生物合成的一些细节。　　本研究从一株经过长期诱变、高产金霉素的金黄色链霉菌工业菌株出发，首次建立了金黄色链霉菌的遗传操作体系，旨在通过中断目标基因所积累产物的结构和体外酶促生化反应，揭示金霉素生物合成的分子机制，为合成新的四环素类化合物和其它Ⅱ型PKS的研究提供理论依据。　　本研究根据已报道的四环素生物合成基因簇中氯代酶基因序列设计探针，从金黄色链霉菌基因组Fosmid文库中成功克隆到完整的金霉素生物合成基因簇。前期工作中，用传统穿梭质粒介导的同源重组方法，始终无法建立金黄色链霉菌的遗传操作体系。根据分子生物学重组原理，我们改进了方法:利用Fosmid两个较大同源臂（至少有一个在20kb以上）具有相对较高的同源重组效率，成功地进行了金黄色链霉菌的基因敲除。首先在E.coil BW25113中通过入-Red重组酶介导同源重组，在Fosmid11D1(包含金霉素合成完整基因簇ctc)上将目标基因用oriT+ Spec片段置换;然后利用E coli ET12567与Streptomyces之间的接合转移体系，将突变后的Fosmid与金黄色链霉菌染色体进行同源重组，得到最终的金黄色链霉菌突变株。本研究先后中断了金霉素生物合成过程中氯代酶基因（ctcP）、合成起始相关基因（ctcT/ctcl）、所有环化酶基因（ctcD/F/H）和两个氧化酶基因(ctcX/E)，通过对突变株产物进行分析，更清晰地阐明了金霉素生物合成途径。　　与其它四环素类抗生素生物合成过程不同，金霉素生物合成过程中存在一步氯化反应，本研究首先将负责氯化反应的氯代酶(CtcP)进行了中断。本研究的出发菌株金霉素的产量达到15 g/L(92％)，含有7.8％左右的四环素副产物（约1.2 g/L）;工业生产过程中，通过向培养基中添加2.0％(g/L)的溴化钾(KBr)抑制氯化反应，用来生产四环素。将氯代酶基因敲除之后，突变菌株ZT04发酵产物只积累“干净”的四环素，其产量达到工业水平(18 g/L)。分别在天然启动子和红霉素强启动子控制下，将ctcP基因回补到突变株ZT04，均恢复了产金霉素的能力。据此，我们初步推断氯代酶负责的氯化反应应该是发生在最后一步——催化四环素在C7位加上一个氯原子得到金霉素。　　为了进一步验证氯代酶CtcP的功能，用在大肠杆菌中异源表达的CtcP（及其辅酶CtcQ）在体外重构了该步氯化反应。在体外实验中，CtcP具有酶分子典型特征:既具有酶分子催化底物的立体专一性，又表现出一定的底物柔性。在体外反应中，CtcP专一性地催化4S绝对构型的四环素底物(kcat=0.51±0.01 h-1)，但是不能够催化4R构型的底物。实验证实，4S构型的四环素类在体外能够自发异构为4R产物。我们推测这种转变是一种热力学平衡过程，4R构型在热力学上更稳定，发酵产物中4S构型产物同样向4R构型产物自动转化。与此同时，CtcP能够催化两种四环素结构类似物——2-乙酰基-2-脱胺甲酰-四环素(2-ADTC)和6-脱甲基-四环素(6-DMTC)产生了痕量的氯代产物，只能通过LC-MS检测到;另一种四环素结构类似物——土霉素则不能被氯代。　　根据以上实验结果，本研究在工业菌株中提高了氯代酶基因的表达水平，试图将发酵过程中少量的四环素积累完全转化为金霉素。构建具有红霉素强启动子PermE*的基因表达载体，串联重复ctcP基因1至5个拷贝，通过链霉菌整合型质粒分别将它们整合到金黄色链霉菌的基因组上，5组突变株不同程度的提高了金霉素产量，最终筛选到一株金霉素产量提高至173％(26 g/L)的突变株。RT-PCR结果显示，金霉素产量的提高与氯代酶转录水平的提高相一致。但是，所有突变株四环素积累并不能够完全消除，只是比例比原始菌株的7.8％略微下降(5.5％-7.1％)，推测原因可能是由于四环素和金霉素在发酵一开始就会被外排出细胞。至此，可以得出结论:氯代酶在金霉素生物合成过程中是最后一步反应，负责在四环素C7位置上加载氯原子，并且由于氯代酶催化效率不高，氯代反应不完全，导致在金霉素发酵产物中还存在少量四环素。　　在Ⅱ型PKS中，四环素类具有的一个特殊结构是其2-氨甲酰结构。已有文献报道，天冬酰胺转氨酶负责以丙二酸单酰CoA合成该起始单元，但是其反应底物和具体反应机制还没有弄清楚。将ctc基因簇中的天冬酰胺转氨酶基因(ctcT)中断，意外地发现突变株积累以乙酰基为起始单元的两种产物:2-乙酰基-2-脱氨甲酰-四环素(4S和4R，约1-2 g/L)。同时在ctc基因簇中，我们推测另外一个酰基CoA连接酶基因(ctcl)与起始单元2-氨甲酰合成有关:该基因只存在于四环素类生物合成基因簇中，将ctcl中断，突变株仍产金霉素和四环素，只是产量均降低到出发菌株的1％左右。据此，我们认为四环素类生物合成过程中，天冬酰胺合成酶CtcT负责起始单元的转氨，酰基CoA连接酶Ctcl负责产物加载到CoA上;推测基因组上其它的酰基CoA连接酶能够识别乙酰基起始单元，少量互补Ctcl的功能，这个特征在其它Ⅱ型PKS中也有报道。　　将三个环化酶基因敲除后，根据突变株积累的产物，本研究明确了金霉素环化酶对应顺序:环化酶CtcH负责金霉素B环的形成，环化酶CtcD负责金霉素A环的形成;环化酶CtcF与土霉素基因中OxyK同源，后者被证实负责第一个环——D环的形成;至于金霉素（包括四环素类）结构中C环的形成机制，仍然有待研究。　　最后，我们通过基因敲除研究了氧化酶的功能:将氧化酶基因ctcX敲除后，金霉素（约5 g/L）和四环素产量均不到出发菌株的40％，　　而且金霉素的比例从92％下降为68％。据此，本研究推断CtcX可能不是四环素结构合成的必需酶，而是可能起辅助其它酶分子的氧化作用。将氧化酶基因ctcE敲除之后，突变株积累和ActcD相同的化合物而不产金霉素和四环素，我们推测敲除ctcE时影响了临近下游基因ctcD的功能，有待进一步实验验证。