细菌菌影(Bacterial Ghost)是革兰阴性菌通过噬菌体PhiX174裂解基因E的诱导形成不含核酸、核糖体等胞质内容物的细菌空壳。细菌菌影保留了天然细菌完整的外膜结构,不仅可作为疫苗诱导相关免疫应答,也可作为DNA、抗原和药物等的递送载体。淋病奈瑟菌是性传播疾病淋病(Gonorrhea)的病原菌。随着耐药菌株的增多,抗生素治疗效果并不理想。新型疫苗是新的淋病防治策略之一,淋病奈瑟菌外膜孔蛋白B(PorB)是研制淋病疫苗理想的候选抗原。然而,研究发现淋病DNA疫苗可能在体内转染效率不高导致诱导的免疫应答比较弱,无法满足机体相应的免疫保护需要。本研究旨在借助新型的递送载体细菌菌影来提高淋病奈瑟菌PorB DNA疫苗的免疫保护性。通过沙门菌菌影SE-ghost装载淋病奈瑟菌PorB基因疫苗制备淋病疫苗SE-ghost (PorB),并对其免疫原性及免疫应答机制进行研究。研究内容包括以下两部分：一、沙门菌菌影作为载体装载外源物质体外转染细胞的评价‘将含有温控系统的重组沙门菌HA2-EBOX进行诱导制备出沙门菌菌影SE-ghost。用扫描电镜和透射电镜对SE-ghost进行形态学观察。结果显示,重组沙门菌胞质内容物流出形成菌影。将异硫氰酸荧光素FITC装载入SE-ghost并在体外分别转染3LL细胞、HeLa细胞和RAW264.7细胞48h后,荧光显微镜和流式细胞仪检测转染细胞内的荧光；将SE-ghost冻干粉重悬于真核表达质粒pEGFP-N1缓冲液中,采用分光光度计检测样品离心后上清游离DNA含量分析装载效率,体外转染RAW264.7细胞48h后,荧光显微镜和流式细胞仪检测转染细胞内绿色荧光蛋白。结果表明,SE-ghost装载的FITC在3LL细胞、HeLa细胞和RAW264.7细胞中显示黄绿色荧光；SE-ghost装载的质粒pEGFP-N1在RAW264.7细胞中表达了绿色荧光蛋白。二、以沙门菌菌影为递送载体的淋病奈瑟菌PorB基因疫苗免疫应答特性研究将SE-ghost冻干粉重悬于真核表达质粒pVAX1-PorB缓冲液中制备沙门菌菌影装载的淋病疫苗SE-ghost (PorB)。经SE-ghost (PorB)刺激原代培养诱导的BALB/c小鼠骨髓树突状细胞(BMDC),流式检测BMDC表面分子CD86、CD80、CD40和MHC-Ⅱ的表达；间接ELISA检测BMDC上清的细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70的分泌。流式检测BMDC对同种异体CD4+T细胞增殖的情况。结果表明,成功制备出沙门菌菌影装载的淋病候选疫苗SE-ghost (PorB)。 BMDC经SE-ghost (PorB)刺激后,高表达表面成熟分子CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ;高分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70;刺激同种异体T细胞增殖的能力显著提高。将40只6周龄左右BALB/c小鼠,随机分为4组：SE-ghost (PorB)组、pVAX1-PorB组、SE-ghost组和PBS对照组。通过灌胃口服的方式免疫接种。间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平和阴道洗液IgA抗体水平。用淋病奈瑟菌WHO-A菌株,检测第三次免疫小鼠血清中补体介导的抗体杀菌活性。结果表明,与对照组相比,SE-ghost (PorB)免疫组小鼠血清中IgG和阴道洗液IgA抗体水平明显提高,血清抗体具有补体介导的杀菌作用。流式检测第三次免疫小鼠外周血CD3+CD4+T、CD3+ CD8+T细胞频率变化,胞内染色检测脾脏CD4+T细胞亚群细胞因子IL-4、IFN-γ分泌情况。取第三次免疫小鼠脾细胞,经淋病奈瑟菌WHO-A刺激48h,流式检测脾细胞增殖情况。结果表明,与对照组相比,SE-ghost (PorB)免疫组小鼠外周血CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞频率上调；胞内染色脾脏CD4+T细胞细胞因子IL-4和IFN-γ含量增加。淋病奈瑟菌WHO-A刺激48h, SE-ghost (PorB)免疫组小鼠脾细胞明显增殖。