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研究植物开花时间调控的分子机制对于调节植物繁殖和发育、提高作物产量和品质具有重大的意义。实验室前期研究从拟南芥T-DNA插入突变体库中筛选获得了一株早花突变体efs-1(early flowering in short mutant1),通过Genome Walking技术和生物信息学方法鉴定出一个新的拟南芥开花调控相关基因EFS1,通过互补回复和超表达试验,确定了EFS1基因为拟南芥开花调控基因,利用RT-PCR和Real-Time PCR技术,初步确定了EFS1基因可能通过GA、春化和光周期途径调控拟南芥开花。为进一步明确EFS1基因在拟南芥开花调控途径中的功能,本试验利用反义RNA和RNAi技术,获得EFS1基因功能缺失突变体,验证了EFS1基因的功能；通过检测春化,赤霉素对花期和EFS1基因表达的影响,初步确定EFS1基因参与的拟南芥开花调控途径；通过构建及获得并鉴定开花关键基因的超表达、T-DNA插入突变体,为进一步明确EFS1基因所参与的拟南芥开花调控途径及在途径中的位置奠定基础。
1.春化和赤霉素处理拟南芥野生型、efs-1突变体、回复及超表达突变体,通过分析春化和赤霉素处理对花期及EFS1基因表达的影响,初步确定了EFS1基因主要通过光周期途径和赤霉素途径控制着植物的成花。
2.构建了EFS1基因反义RNA和RNAi载体pCAMBIA1300-EFS1A和pCAMBIA1300-EFS1i,经农杆菌介导转化拟南芥突变体efs-1,通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得了11株RNAi转基因植株和10株反义RNA转基因植株。RT-PCR分析发现,转基因植株中EFS1基因的表达均受到不同程度的抑制,确定所得转基因植株均为EFS1基因的(反义RNA／RNAi)功能缺失突变体。对野生型和各种突变体植株的表型进行观察,进一步确定了EFS1基因缺失导致植株早花。
3.构建了开花途径中关键基因CO租FLC的超表达载体pCAMBIA1300-CO和pCAMBIA1300-FLC,经农杆菌介导转化拟南芥野生型Col-0。通过潮霉素筛选及PCR和RT-PCR鉴定,获得9株CO超表达转基因植株和8株FLC超表达转基因植株。
4.从拟南芥SALK库中获得了拟南芥开花途径中关键基因GI、CO、LHY、FVE及EFS1的T-DNA插入突变体(SALK092757、CS870084、SALK149287、SALK027724(CS878321)和SAIL_122_H09)。利用PCR技术,获得了GI、CO、LHY、FVE及EFS1基因的纯合突变体。
5.构建了EFS1基因的酵母诱饵表达载体pAS1-EFS-CDS,为进一步筛选EFS1的互作蛋白奠定基础。