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研究背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是发病率仅次于阿尔茨海默病的第二大常见的中枢神经系统退行性疾病,以运动迟缓、静止性震颤、肌强直、姿势步态异常等运动症状为主要特征,晚期可出现认知障碍甚至痴呆表现,导致生活能力下降甚至可致残,给家庭及社会带来了沉重的负担。然而,当前的治疗措施仅能改善症状,并不能延缓或阻断多巴胺能神经元进行性退变的趋势。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）具有显著增殖、自我更新及高分化潜能,可向神经元、神经胶质细胞等定向诱导分化,并且同时还有来源丰富、易分离、易培养、免疫调节性、旁分泌作用、低免疫原性、无致瘤性、有限的伦理道德问题等特性,广泛应用于神经系统退行性疾病的细胞治疗。研究表明,hUC-MSCs可体外定向诱导分化为成熟的多巴胺能样神经元,且hUC-MSCs源性多巴胺能样神经元移植较单纯的hUC-MSCs移植效果更佳,因此,hUC-MSCs源性多巴胺能样神经元移植可能会成为PD细胞替代治疗的理想方案之一。研究表明,只有5%-10%的移植多巴胺能样细胞可以在移植过程中存活[1],这一数量远远不足以产生对PD的显著治疗效果。因此,如何促进移植神经元的存活已成为PD细胞替代治疗中一个亟待解决的重点与难点问题。已有研究表明,通过载体介导的成纤维细胞生长因子-20或人血管内皮生长因子基因转导修饰的hUC-MSCs移植可显著改善PD模型大鼠的行为学症状,且优于单独的hUC-MSCs移植[2,3],提示某些基因转导的hUC-MSCs可以产生更好的疗效。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是人脑中最常见的神经营养因子之一,以高亲和力结合酪氨酸激酶B（TrkB）,刺激促存活机制,对神经元的存活、发育、增殖和分化均起重要促进作用,同时,BDNF也可以促进干细胞向神经元定向分化,并促进其成熟。但BDNF过表达对hUC-MSCs源性多巴胺能样神经元的作用目前尚不明确。研究目的体外探讨BDNF过表达的hUC-MSCs源性多巴胺能样神经元的可能作用与机制。研究方法使用组织块法分离出健康足月剖宫产的新生儿脐带组织中的MSCs,并传代培养,将P3代细胞定向诱导分化为多巴胺能样神经元。采用免疫荧光检测诱导前后NeuN、β-tubulin-Ⅲ的表达及TH和Nurr1的共表达。分别用绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）-空载体、GFP-BDNF过表达载体及BDNF siRNA转染hUC-MSCs源性多巴胺能样神经元,将实验分为五组:hUC-MSCs组、多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+过表达BDNF载体组、多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组。通过免疫荧光鉴定各组GFP表达及观察TH和Nurr1共表达情况。采用Western blot检测各组细胞TH、Nurr1、PI3K、Akt、p-Akt、TrKB和BDNF的表达情况。研究结果1.hUC-MSCs可向多巴胺能样神经元定向诱导分化,免疫荧光显示,定向诱导后NeuN、β-tubulin-Ⅲ的表达较诱导前明显增多（P<0.01）;诱导后双标TH和Nurr1共表达较诱导前明显增多（P<0.01）。2.免疫荧光鉴定各组GFP表达:结果显示,多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+过表达BDNF载体组可见明显绿色荧光表达;hUC-MSCs组、多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+BDNFsiRNA组均未见绿色荧光表达。3.免疫荧光鉴定各组TH和Nurr1共表达:结果显示,多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+BDNF组、多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组TH和Nurr1共表达较hUC-MSCs组明显增多（P<0.01）;多巴胺能样神经元组和多巴胺能样神经元+空载体组TH和Nurr1共表达无明显差异;多巴胺能样神经元+BDNF组TH和Nurr1共表达较多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组及多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组明显增多（P<0.01）;多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组TH和Nurr1共表达较多巴胺能样神经元组及多巴胺能样神经元+空载体组明显减少（P<0.01）。4.Western blot检测各组细胞TH、Nurr1、PI3K、Akt、p-Akt、TrKB和BDNF的表达:结果显示,多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+BDNF组、多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组TH、Nurr1、PI3K、Akt、p-Akt和TrKB的表达较hUC-MSCs组明显增多（P<0.01）;多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组、多巴胺能样神经元+BDNF组BDNF的表达较hUC-MSCs组明显增多（P<0.01）;多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组与hUC-MSCs组之间BDNF表达无显著差异;多巴胺能样神经元组和多巴胺能样神经元+空载体组TH、Nurr1、PI3K、Akt、p-Akt、TrKB和BDNF的表达无明显差异;多巴胺能样神经元+BDNF组TH、Nurr1、PI3K、Akt、p-Akt、TrKB和BDNF的表达较多巴胺能样神经元组、多巴胺能样神经元+空载体组及多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组明显增多（P<0.01）;多巴胺能样神经元+BDNF siRNA组TH、Nurr1、PI3K、Akt、p-Akt、TrKB和BDNF的表达较多巴胺能样神经元组及多巴胺能样神经元+空载体组明显减少（P<0.01）。研究结论1.hUC-MSCs在体外可以向多巴胺能样神经元定向诱导分化。2.BDNF过表达可促进hUC-MSCs源性多巴胺能神经元的转化与成熟,其机制可能与上调PI3K/Akt信号通路有关。