目的:糖尿病是一组以血浆葡萄糖水平增高为特征的慢性代谢性疾病,其病理特点是胰岛β细胞功能受损和/或胰岛素抵抗。近年来,越来越多的研究表明,铁过载可增加糖尿病的患病风险,体内铁过载是2型糖尿病的独立危险因素。铁是人体内含量最多的必需微量元素,铁稳态对于细胞信号转导和内环境的稳态至关重要。铜蓝蛋白(ceruloplasmin,Cp)是铁转运过程中的关键酶,主要在肝细胞合成,具有亚铁氧化酶活性,可将Fe2+氧化成Fe3+,促进铁与转铁蛋白结合。Cp基因敲除(Cp-/-)后可以导致组织铁过载,以及糖耐量异常,但其具体机制不详。茶多酚是一种天然的抗氧化剂,具有螯合铁的特性,目前茶多酚对Cp-/-小鼠糖代谢的影响机制尚未见详细报道。本课题组以Cp基因敲除(内源性铁过载)小鼠为研究对象,探讨铁过载导致糖代谢异常的具体作用机制;同时,应用茶多酚灌胃进行干预治疗,明确茶多酚对Cp基因敲除小鼠糖代谢的影响,以期为糖尿病患者提供新的治疗选择。方法:随机选取12只10月龄雌性BALB/c J×129Sv J品系铜蓝蛋白基因敲除(Cp-/-)小鼠作为实验组,另选取12只同性别、同月龄、同品系的野生型(Cp+/+)小鼠作为对照组,将实验组和对照组小鼠分别随机分为茶多酚干预组(TPG,n=6)和生理盐水处理组(NSG,n=6)进行干预,4周后,通过葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验评估小鼠胰岛β细胞的储备功能和胰岛素敏感性。放射免疫法检测小鼠血清胰岛素水平;比色法检测肝脏非血红素铁含量;免疫组化法检测胰腺铁沉积情况;黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、硫代巴比妥酸法测定丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量以明确肝脏氧化应激水平;原位末端标记(terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)法检测肝实质细胞和胰岛β细胞的凋亡情况;Real-time PCR测定肝脏葡萄糖转运体2(glucose transporter,GLUT2)、胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate 2,IRS2)mRNA表达水平;Western-blot法测定肝脏GLUT2、IRS2的蛋白表达水平。应用spss21.0统计软件进行统计分析,所有计量资料均进行正态性检验,正态分布数据以平均值±标准差(?x±sd)表示,非正态分布数据以(最小值,最大值)表示。正态分布且方差齐性数据,采用单因素方差分析,两两比较采用lsd检验。不符合正态分布的资料采用独立样本的kruskal-wallis秩和检验。以p<0.05为差异有统计学意义。结果:1与cp+/+nsg小鼠相比,cp-/-nsg小鼠血糖显著升高(葡萄糖耐量实验各点血糖值:0min6.80±0.91mmol/l比4.98±0.71mmol/l,p0min=0.004;15min14.88±0.69mmol/l比12.70±0.67mmol/l,p15min=0.011;30min15.45±0.97mmol/l比8.85±0.79mmol/l,p30min<0.001;60min10.30±1.61mmol/l比7.75±0.37mmol/l,p60min=0.004;120min8.00±0.70mmol/l比5.68±0.34mmol/l,p120min<0.001),胰岛素敏感性显著下降(胰岛素耐量实验各点血糖值:0min7.15±1.20mmol/l比5.13±0.54mmol/l,p0min=0.001;15min5.58±0.87mmol/l比4.18±0.49mmol/l,p15min=0.014;30min3.55±0.60mmol/l比2.80±0.28mmol/l,p30min=0.013;60min2.30±0.22mmol/l比1.63±0.25mmol/l,p60min<0.001)。cp+/+tpg与cp+/+nsg组间血糖无显著差异(葡萄糖耐量实验各点血糖值:0min4.35±0.68mmol/l比4.98±0.71mmol/l,p0min=0.245;15min12.70±1.44mmol/l比12.70±0.67mmol/l,p15min=1.000;30min8.23±0.75mmol/l比8.85±0.79mmol/l,p30min=0.450;60min7.68±0.54mmol/l比7.75±0.37mmol/l,p60min=0.919;120min4.90±0.78mmol/l比5.68±0.34mmol/l,p120min=0.091),胰岛素敏感性也无明显变化(胰岛素耐量实验各点血糖值:0min4.95±0.24mmol/l比5.13±0.54mmol/l,p0min=0.726;15min4.03±0.73mmol/l比4.18±0.49mmol/l,p15min=0.763;30min2.33±0.26mmol/l比2.80±0.28mmol/l,p30min=0.089;60min1.43±0.10mmol/l比1.63±0.25mmol/l,p60min=0.167)。与cp-/-nsg小鼠相比,cp-/-tpg小鼠血糖明显降低(葡萄糖耐量实验各点血糖值:0min5.65±0.53mmol/l比6.80±0.91mmol/l,p0min=0.044;15min13.23±1.08mmol/l比14.88±0.69mmol/l,p15min=0.042;30min12.70±1.74mmol/l比15.45±0.97mmol/l,p30min=0.005;60min7.23±1.08mmol/l比10.30±1.61mmol/l,p60min=0.001;120min5.45±0.47mmol/l比8.00±0.70mmol/l,p120min<0.001),胰岛素敏感性显著升高(胰岛素耐量实验各点血糖值:0min5.10±0.35mmol/l比7.15±1.20mmol/l,p0min=0.001;15min4.13±0.61mmol/l比5.58±0.87mmol/l,p15min=0.011;30min2.53±0.15mmol/l比3.55±0.60mmol/l,p30min=0.002;60min1.48±0.17mmol/l比2.30±0.22mmol/l,p60min<0.001)。2血清胰岛素水平:与cp+/+nsg相比,cp-/-nsg小鼠血清空腹胰岛素水平明显升高,但第一时相胰岛素分泌无统计学差异(0min37.93±3.36uiu/ml比33.91±2.38uiu/ml,p0min=0.036;79.31±7.84uiu/ml比68.81±6.89uiu/ml,p30min=0.068);cp+/+tpg和cp+/+nsg组间空腹血清胰岛素及第一时相胰岛素水平均无明显差异(31.58±2.09uiu/ml比33.91±2.38uiu/ml,p0min=0.198;69.11±8.38uiu/ml比68.81±6.89uiu/ml,p30min=0.956);茶多酚干预4周后,与cp-/-nsg组相比,cp-/-tpg组小鼠血清空腹胰岛素水平降低,但第一时相胰岛素分泌无统计学差异(33.88±1.44uiu/ml比37.93±3.36uiu/ml,p0min=0.035;71.35±6.37uiu/ml比79.31±7.84uiu/ml,p30min=0.154)。3肝脏组织铁含量:与cp+/+nsg相比,cp-/-nsg小鼠肝脏发生了严重铁沉积(21.47±3.53mg/gprot比3.04±0.61mg/gprot,p<0.001),经茶多酚干预4周后,与cp-/-nsg相比,cp-/-tpg小鼠肝脏铁沉积得到了明显改善(10.77±1.13mg/gprot比21.47±3.53mg/gprot,p<0.001)。但cp+/+tpg与cp+/+nsg组间未见显著差异(2.68±0.55mg/gprot比3.04±0.61mg/gprot,p=0.827)。4胰岛素免疫组化与铁沉积普鲁士蓝染色结果显示,铁沉积主要发生在胰腺外分泌部的胰腺腺泡细胞,而非胰岛β细胞。胰腺凋亡也主要发生在胰腺外分泌部的胰腺腺泡细胞,而非胰岛β细胞。5氧化应激:与生理盐水处理的野生组小鼠相比,cp-/-nsg小鼠sod水平显著降低(1.70±0.27u/mgprot比2.11±0.09u/mgprot,p=0.005)、mda水平明显升高(5.46±0.51nmol/mgprot比4.41±0.43nmol/mgprot,p=0.001);经茶多酚干预4周后,cp-/-tpg小鼠sod水平显著升高(2.46±0.21u/mgprot比1.70±0.27u/mgprot,p<0.001)、mda水平明显降低(4.75±0.48nmol/mgprot比5.46±0.51nmol/mgprot,p=0.019)。此外,与生理盐水处理的野生组小鼠相比,茶多酚干预的野生组小鼠sod水平明显升高(2.53±0.14u/mgprot比2.11±0.09u/mgprot,p=0.004)、mda水平显著降低(3.76±0.25nmol/mgprot比4.41±0.43nmol/mgprot,p=0.031)。6cp-/-nsg小鼠肝细胞凋亡数显著高于cp+/+nsg小鼠(67.00±4.58比13.67±2.08,p<0.001),经茶多酚灌胃干预后,cp-/-tpg小鼠肝细胞凋亡数较cp-/-nsg明显降低(38.33±5.03比67.00±4.58,p<0.001)。cp+/+tpg与cp+/+nsg两组间肝细胞凋亡数目无显著差异(12.67±2.52比13.67±2.08,p=0.754)。7与cp+/+nsg相比,cp-/-nsg小鼠肝脏irs2mrna和蛋白表达水平[(0.09,0.29)比(0.42,0.78),pmrna=0.011;(0.52±0.05比0.70±0.07),pprotein=0.024],以及肝脏glut2mrna和蛋白表达水平显著降低[(0.03±0.02比0.97±0.13),pmrna<0.001;(0.45±0.05比0.81±0.06),pprotein<0.001];经茶多酚为期4周的干预后,与cp-/-nsg组相比,cp-/-tpg组小鼠肝脏irs2mrna和蛋白表达水平[(0.46,0.88)比(0.09,0.29),pmrna=0.006;(0.69±0.05比0.52±0.05),pprotein=0.029],以及肝脏glut2mrna和蛋白表达水平[(0.96±0.23比0.03±0.02),pmrna<0.001;(0.75±0.06比0.45±0.05),pprotein<0.001]显著升高。cp+/+nsg组和cp+/+tpg组小鼠肝脏irs2mrna和蛋白表达水平[(0.74,1.48)比(0.42,0.78),pmrna=0.077;(0.72±0.12比0.70±0.07),pprotein=0.759],以及肝脏glut2mrna和蛋白表达水平[(1.02±0.22比0.97±0.13),pmrna=0.755;(0.84±0.04比0.81±0.06),pprotein=0.478]无显著变化。结论:1铜蓝蛋白基因敲除可导致糖代谢异常,血糖升高的原因是胰岛素抵抗而非胰岛素分泌功能受损;2铜蓝蛋白基因敲除可导致胰岛素作用的靶器官(肝脏)发生铁沉积,后者导致肝脏氧化应激紊乱,细胞凋亡增加,肝脏irs2、glut2表达降低,引起胰岛素抵抗,并最终导致糖代谢异常。3茶多酚通过螯合肝脏组织铁,减轻肝脏铁沉积及机体的氧化应激水平,最终改善铁过载引起的糖代谢异常。