目的胃肠动力障碍是功能性消化不良(FD)的主要病理生理学基础。胃肠卡哈尔间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)结构和功能异常与胃肠动力障碍密切相关。本研究以FD大鼠为研究对象,选取足三里穴位,研究电针干预对FD大鼠胃肠ICC的影响,同时选用AMPK抑制剂Compound C,探讨电针通过AMPK/ULK1信号通路调节FD大鼠ICC自噬的可能作用机制。方法SPF级雄性SD大鼠82只,适应性喂养一周后,随机分为正常组(n=12)以及造模组(70只)。造模组大鼠采用郭氏夹尾刺激+隔日喂养+0℃生理盐水灌胃的多因素应激干预法构建FD模型,造模周期为2周。造模结束后,从中选取60只造模成功的大鼠随机分为模型组、电针组、假针刺组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组,每组各12只。电针组选取大鼠双侧后肢足三里穴位,针刺后连通韩氏穴位电针治疗仪,选择连续波,2Hz,1m A,干预疗程为1次/天,总共干预天数7天。假针刺组大鼠采用特制Streitberger装置针灸针,针头设计成套叠样式钝针头,当钝针头针刺向皮肤后,可自动缩回针套里面,接着使用配套的橡胶圈用医用胶布固定于相应部位,不予通电,其余同电针组。AMPK抑制剂组大鼠采用Compound C(20mg/kg)腹腔注射,1次/天,总共注射7天。电针+AMPK抑制剂组大鼠采用腹腔注射Compound C,剂量及干预疗程同AMPK抑制剂组,抑制剂注射完成20min后,给予电针干预,电针干预方法及疗程同电针组。在干预期间,给予正常组、模型组、抑制剂组大鼠进行束缚固定操作,保证各组实验条件一致性。干预前后期间,观察各组大鼠一般情况,测量大鼠体重、进食量。干预结束后,大鼠禁食不禁水24h,各组随机选取4只大鼠进行胃电图测定。各组剩余大鼠依次给予营养性半固体糊(2ml/100 g)、墨汁(1ml/100 g)灌胃,半小时以后给予麻醉药10%水合氯醛(0.35m L/100g)腹腔注射,依次麻醉大鼠后进行取材,测定各组大鼠胃内残留率和小肠推进率。取各组大鼠部分胃窦组织和十二指肠组织,HE染色观察胃窦组织和十二指肠组织病理形态学;Western blot检测各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit、Cx43、LC3、Beclin1、p62、p-AMPK、AMPK、p-ULK1、ULK1、p-LKB1、LKB1、Ca MKK2蛋白表达;PCR检测各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit、Cx43、Beclin1 m RNA水平;免疫荧光双标法检测各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit/LC3、c-kit/Beclin1共定位表达情况;运用透射电镜观察各组大鼠胃窦和十二指肠组织ICC超微结构改变。结果1.电针对FD大鼠一般行为学、胃肠动力的影响各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织形态学(HE)改变:肉眼观察仅模型组、假针刺组大鼠胃黏膜颜色偏白,各组大鼠显微镜下观察,组织各层形态正常,未见溃疡、出血等器质性改变。(1)电针干预改善FD大鼠一般行为学指标造模前后比较:与正常组比较,其余五组大鼠体重增长均明显下调(均P<0.01),且模型组、电针组、假针刺组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组组间进行比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。干预前后比较:与正常组比较,模型组、假针刺组两组大鼠体重增长均显著下调(均P<0.01);与模型组比较,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠体重增长均显著上调(均P<0.01);电针+AMPK抑制剂组体重增长高于电针组和AMPK抑制剂组(均P<0.01);电针组与AMPK抑制剂组两组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05))。(2)电针干预改善FD大鼠胃肠动力障碍各组大鼠胃内残留率变化:与正常组比较,模型组、假针刺组两组大鼠胃内残留率均显著升高(均P<0.01);与模型组相比,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃内残留率均显著降低,差异有统计学意义(均P<0.01);电针+AMPK抑制剂组大鼠胃内残留率分别低于电针组、AMPK抑制剂组(P<0.05,P<0.01);电针组与AMPK抑制剂组两组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠小肠推进率变化:与正常组比较,模型组、假针刺组两组小肠推进率均显著下降(均P<0.01);与模型组比较,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组小肠推进率均显著上升,差异具有统计学意义(均P<0.01);电针+AMPK抑制剂组小肠推进率分别高于电针组、A MPK抑制剂组(P<0.05,P<0.01);电针组与AMPK抑制剂组两组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)各组大鼠胃电节律改变:与正常组比较,模型组、假针刺组两组大鼠胃电慢波主频率、主功率均显著降低(均P<0.01);与模型组比较,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组胃电慢波主频率明显增加(P<0.01,P<0.05,P<0.01),主功率也明显增加(均P<0.01);电针+AMPK抑制剂组主功率分别高于电针组、AMPK抑制剂组(P<0.01,P<0.05);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组胃电慢波主频率比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。2.电针对FD大鼠ICC的影响(1)Western blot检测c-kit、Cx43蛋白表达各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit蛋白表达水平如下:与正常组比较,模型组、假针刺组两组胃窦组织和十二指肠组织c-kit表达均明显减少(均P<0.01);与模型组比较,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组胃窦组织和十二指肠组织c-kit表达增加(均P<0.01);与电针组比较,AMPK抑制剂组胃窦组织和十二指肠组织c-kit表达量明显下调(P<0.01,P<0.05);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组胃窦组织和十二指肠组织c-kit表达明显上调(均P<0.01);模型组与假针刺组、电针组与电针+AMPK抑制剂组之间c-kit表达量无明显差异(均P>0.05)。各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Cx43蛋白表达水平如下:模型组和假针刺组胃窦组织和十二指肠组织Cx43表达低于正常组(均P<0.01);与模型组相比,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组胃窦组织Cx43表达上调(均P<0.01),十二指肠组织Cx43表达上调(P<0.01,P<0.05,P<0.01);与电针组比较,AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织Cx43蛋白表达量明显下调(P<0.05);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织Cx43蛋白表达量明显上调(P<0.05);模型组与假针刺组、电针组与电针+AMPK抑制剂组之间Cx4表达比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。(2)q PCR检测c-kit、Cx43 m RNA表达水平各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit m RNA表达水平如下:与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit m RNA表达明显下调(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit m RNA表达高于模型组(均P<0.01);AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit m RNA表达低于电针组(均P<0.01);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit m RNA表达量明显上调(均P<0.01);模型组与假针刺组、电针组与电针+AMPK抑制剂组之间c-kit m RNA无明显差异(均P>0.05)。各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Cx43 m RNA表达水平如下:与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Cx43 m RNA表达明显下调(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Cx43 m RNA表达高于模型组(均P<0.01);与电针组比较,AMPK抑制剂组胃窦组织和十二指肠组织Cx43m RNA表达下调(均P<0.01);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Cx43 m RNA表达明显上调(均P<0.01);模型组与假针刺组、电针组与电针+AMPK抑制剂组之间Cx43 m RNA表达比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。3.电针对FD大鼠ICC自噬的影响(1)透射电镜观察ICC超微结构变化正常组ICC细胞呈长梭型或星型,核大,核周边缘呈异染色致密带,胞质和突起内有丰富的线粒体和大量中间丝,粗面和滑面内质网丰富,高尔基体发育成熟,胞质边缘可见大量细胞膜穴样内陷结构,基板多不连续,自噬体少见,向不同方向发出2条以上长突起,相邻ICC突起之间、ICC与胃肠SMC之间可见缝隙连接,还可见ICC分布与胃肠神经纤维束相邻,并形成突触样前后膜连接;模型组、假针刺组显示ICC超微结构破坏,核形态异常,胞质部分溶解,内有空泡,线粒体肿胀,内嵴消失,粗面内质网减少,可见明显的自噬体,突起断裂,与SMC缝隙连接减少;电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组ICC线粒体肿胀不明显,自噬体结构不明显,突起正常,可见缝隙连接和突触样连接。(2)Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表达水平各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值如下:与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组胃窦组织和十二指肠组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均低于模型组(均P<0.01);AMPK抑制剂组大鼠十二指肠组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值高于电针组(P<0.01);电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值低于AMPK抑制剂组(P<0.05,P<0.01);模型组与假针刺组之间、电针组与电针+AMPK抑制剂组之间,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值无明显差异(均P>0.05)。各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织自噬相关基因Beclin1蛋白表达水平如下:与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织自噬相关基因Beclin1表达上调(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃窦组织和十二指肠组织自噬相关基因Beclin1表达低于模型组(均P<0.01);电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织自噬相关基因Beclin1表达低于AMPK抑制剂组(P<0.01,P<0.05);模型组与假针刺组之间、电针组与AMPK抑制剂组和电针+AMPK抑制剂组之间,自噬相关基因Beclin1表达水平无明显差异(均P>0.05)。各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p62蛋白表达水平如下:模型组、假针刺组两组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p62表达低于正常组(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p62表达高于模型组(均P<0.01);与电针组、AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p62表达上调(P<0.05,P<0.01);模型组与假针刺组之间、电针组与AMPK抑制剂组之间p62表达无明显差异(均P>0.05)。(3)q PCR检测Beclin 1 m RNA表达水平各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Beclin 1 m RNA表达水平如下:与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织自噬相关基因Beclin1 m RNA表达水平明显上升(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃窦组织和十二指肠组织自噬相关基因Beclin1 m RNA表达低于模型组(均P<0.01);AMPK抑制剂组大鼠十二指肠组织自噬相关基因Beclin1 m RNA表达水平高于电针组(P<0.05);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织自噬相关基因Beclin1 m RNA表达水平明显下降(均P<0.05);模型组与假针刺组之间、电针组与电针+AMPK抑制剂组之间自噬相关基因Beclin1 m RNA表达水平比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。(4)电针对FD大鼠c-kit/LC3相对表达量影响免疫荧光染色可见,c-kit染色阳性为红色荧光,LC3染色阳性为绿色荧光。结果显示,与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit阳性细胞数明显减少(均P<0.01);与模型组相比,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit阳性细胞数显著增加(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组之间c-kit阳性细胞数比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织LC3阳性细胞数明显增加(均P<0.01);与模型组相比,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织LC3阳性细胞数明显减少(均P<0.01);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织LC3阳性细胞数明显下调(P<0.05);电针组、AMPK抑制剂组两组之间LC3阳性细胞数差异无统计学意义(均P>0.05)。(5)电针对FD大鼠c-kit/Beclin1相对表达量影响免疫荧光染色可见,c-kit染色阳性为红色荧光,Beclin1染色阳性为绿色荧光。结果显示,与正常组比较,模型组、假针刺组两组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit阳性细胞数明显减少(均P<0.01);与模型组相比,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃窦组织和十二指肠组织c-kit阳性细胞数增加(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组之间c-kit阳性细胞数差异无统计学意义(均P>0.05)。与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Beclin1阳性细胞数显著增加(均P<0.01);与模型组相比,电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Beclin1阳性细胞数明显减少(均P<0.01);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠十二指肠组织Beclin1阳性细胞数减少(P<0.05);电针组、AMPK抑制剂组之间Beclin1阳性细胞数无明显差别(均P>0.05)。4.电针对FD大鼠AMPK/ULK1信号通路的影响。各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织中,p-AMPK/AMPK比值比较:与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p-AMPK/AMPK比值升高(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组三组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p-AMPK/AMPK比值均低于模型组(均P<0.01);与电针组比较,AMPK抑制剂组大鼠十二指肠组织p-AMPK/AMPK比值明显上升(P<0.01);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p-AMPK/AMPK比值明显下降(P<0.05,P<0.01);模型组与假针刺组之间、电针组与电针+AMPK抑制剂组之间p-AMPK/AMPK比值无明显差异(均P>0.05)。各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p-ULK1/ULK1比值比较:与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p-ULK1/ULK1比值上调(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p-ULK1/ULK1比值均低于模型组(均P<0.01);与AMPK抑制剂组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p-ULK1/ULK1比值下调(P<0.05,P<0.01);模型组与假针刺组之间、电针组与电针+AMPK抑制剂组之间p-ULK1/ULK1比值无明显差异(均P>0.05)。各组大鼠胃窦组织和十二指肠组织p-LKB1/LKB1比值比较:p-LKB1/LKB1在六组间表达差异无统计学意义(均P>0.05)。各组大鼠胃窦组织和十二指肠组Ca MKK2蛋白水平表达如下:与正常组比较,模型组、假针刺组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Ca MKK2表达增加(均P<0.01);电针组、AMPK抑制剂组、电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Ca MKK2表达均低于模型组(均P<0.01);与电针组比较,电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Ca MKK2表达明显下降(均P<0.05);电针+AMPK抑制剂组大鼠胃窦组织和十二指肠组织Ca MKK2表达低于AMPK抑制剂组(均P<0.01);模型组与假针刺组之间、电针组与AMPK抑制剂组之间Ca MKK2表达比较无显著差异(均P>0.05)。结论1.FD大鼠胃排空延迟,胃电慢波减少,胃肠ICC数量及超微结构受损。2.电针干预可以改善FD大鼠胃电节律和胃肠动力障碍,并且改善FD大鼠一般行为。3.电针干预可以促进胃肠道ICC数量和网络结构的恢复,抑制ICC过度自噬,AMPK抑制剂Compound C与电针联合运用具有协同作用。4.电针干预通过AMPK/ULK1自噬信号通路调节FD大鼠胃肠道ICC,恢复FD大鼠胃肠ICC结构及功能,改善FD胃肠动力障碍,是电针治疗FD大鼠的可能作用机制。