研究背景与研究目的:在全世界范围之内,胃癌的发病率在所有肿瘤中居于第五位,在所有肿瘤相关死亡原因中居第三位。当前医疗条件下,综合治疗策略的进步已经使胃癌的治疗效果大幅度提高。然而,大多数的胃癌患者的预后却依然较差,这主要是由于大部分患者在诊断时已经处于疾病的进展期以及对胃癌发生侵袭转移的相关分子机制知之甚少。因此,对于胃癌发生侵袭转移的分子机制的更多了解将有助于为胃癌患者提供更有效的治疗策略。神经纤毛及唾样蛋白2(Neuropilin and tolloid-like 2,NETO2)最初在神经系统中被发现,其作为红藻氨酸受体的组件,在红藻氨酸受体的功能调控中发挥重要作用。NETO2在海马神经元中能够同有活性的低聚体K~+-Cl~-共同转运体(KCC2)相结合并增强其循环功能。近年来,研究发现NETO2的mRNA水平在许多肿瘤显著上调。在结直肠癌中,NETO2高表达同疾病TNM分期及较差预后显著正相关;在肝细胞癌中,NETO2被确定为可以判断患者预后较差的五个转录组基因标签之一。然而,NETO2在胃癌中的表达及其分子功能仍然未知。本研究旨在阐明NETO2在胃癌中的表达特性及分子功能,并探讨其调控胃癌侵袭转移的分子机制,以论证NETO2作为胃癌预后新指标及成为靶向治疗新靶点的可行性和可能性。材料与方法:1.通过免疫组织化学染色及评分、NCBI GEO及TCGA数据库检索、qRT-PCR及Western blotting实验分析NETO2在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况。2.通过卡方检验分析NETO2表达与胃癌患者临床病理参数的相关性。3.通过生存分析、单因素及多因素方差分析、KMPLOT数据库和TCGA数据库检索分析NETO2表达情况与胃癌患者生存率之间的相关性。4.通过Western blotting及qRT-PCR检测NETO2在正常胃黏膜上皮细胞系(GES-1),五个胃癌细胞系(SGC7901,BGC823,MKN45,AGS,MGC803)以及原代胃癌细胞系XN0422中的表达情况。筛选表达最高的细胞进行NETO2慢病毒敲低及过表达,并通过慢病毒转染的方法,在两种胃癌细胞中构建NETO2稳定敲低及过表达细胞模型,通过Western blotting及qRT-PCR检测NETO2敲低及过表达效率。5.通过划痕愈合实验检测在胃癌细胞系MGC803以及原代胃癌细胞XN0422中敲低及过表达NETO2对胃癌细胞迁移能力的影响。6.通过transwell侵袭实验检测在胃癌细胞系MGC803以及原代胃癌细胞XN0422中敲低及过表达NETO2对胃癌细胞侵袭能力的影响。7.通过裸鼠腹腔转移模型检测在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低及过表达NETO2对胃癌细胞体内转移能力的影响。8.通过细胞摄影观察在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低及过表达NETO2对胃癌细胞形态的影响。9.通过Western blotting及qRT-PCR检测在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低NETO2对胃癌细胞上皮-间质转化表型分子标志物的影响。10.通过基因芯片及IPA分析检测在胃癌细胞系MGC803中敲低NETO2后对疾病及功能和信号通路的改变情况,分析NETO2调控胃癌细胞侵袭转移的信号通路。11.通过Western blotting检测在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低及过表达NETO2对PI3K/AKT信号通路的影响。12.通过Western blotting及transwell侵袭实验检测PI3K抑制剂LY294002、AKT抑制剂MK2206及AKT持续激活状态质粒转染对敲低或过表达NETO2后PI3K/AKT信号通路、胃癌细胞侵袭能力及上皮-间质转化表型的影响。13.通过Western blotting及双荧光素酶报告基因实验检测在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低及过表达NETO2对NF-κB信号通路的影响。14.通过Western blotting、qRT-PCR、transwell及双荧光素酶报告基因实验检测TNF-α、JSH-23及BAY 11-7082对敲低或过表达NETO2后NF-κB信号通路、Snail的表达、胃癌细胞侵袭能力及上皮-间质转化表型的影响。15.通过Western blotting和qRT-PCR实验检测在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低及过表达NETO2对TNFRSF12A表达的影响。16.通过Western blotting及双荧光素酶报告基因实验检测在胃癌细胞系MGC803中敲低TNFRSF12A对PI3K/AKT及NF-κB信号通路的影响。17.通过Western blotting及双荧光素酶报告基因实验检测在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中过表达NETO2的同时敲低TNFRSF12A对PI3K/AKT及NF-κB信号通路的影响。研究结果:1.我们在220例配对的胃癌组织及癌旁组织中通过免疫组织化学染色的方法检测了NETO2的表达情况,结果发现NETO2在胃癌组织及转移淋巴结中的表达显著高于癌旁组织(p<0.0001)。NETO2高表达的检出率在胃癌组织中为58.18%(128/220),显著高于其在癌旁组织中的检出率37.27%(82/220)(p<0.001)。我们也在6个NCBI GEO胃癌数据库的检索分析中发现类似的结论:GSE29272(p<0.0001),GSE65801(p=0.0002),GSE63089(p<0.0001),GSE54129(p=0.0002),GSE27342(p<0.0001)和GSE13911(p<0.0001)。此外,TCGA数据库的检索分析中也得到类似结论(p<0.05)。我们使用qRT-PCR检测了NETO2在20对新鲜胃癌组织与癌旁组织中的表达,使用Western blotting检测了NETO2在8对新鲜胃癌组织与癌旁组织中的表达,结果均发现NETO2在胃癌组织中表达显著高于癌旁组织。2.我们分析了NETO2表达与胃癌患者临床病理参数的相关性。NETO2的表达与胃癌患者的TNM分期(p=0.004)、肿瘤浸润深度(p=0.016)、淋巴结转移(p=0.022)及肿瘤大小(p=0.045)显著正相关,与胃癌患者年龄(p=0.387)、性别(p=0.585)、组织学分级(p=0.424)、M分期(p=0.112)和肿瘤位置(p=0.467)无相关性。3.生存分析的结果表明高表达NETO2的胃癌患者总生存率(p=0.001)及无病生存率(p=0.009)均显著低于低表达NETO2的胃癌患者。单因素方差分析(p=0.001)及多因素方差分析(p=0.011)均表明NETO2是总生存率的独立预后因素。此外,单因素方差分析(p=0.006)及多因素方差分析(p=0.041)也表明NETO2是胃癌患者无病生存率的独立预后因素。KMPLOT(总生存率:p=0.0379;无病生存率:p=0.0106)和TCGA数据库(总生存率:p=0.0061)的分析结果都表明高表达NETO2的胃癌患者生存率显著低于低表达者。4.Western blotting及qRT-PCR检测结果发现,NETO2在胃癌细胞中的表达显著高于正常胃黏膜上皮细胞系;NETO2在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中表达量最高,并且均成功构建NETO2慢病毒敲低及过表达细胞模型。5.划痕愈合实验结果显示敲低NETO2显著抑制胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422的迁移能力(P<0.05),而过表达NETO2则显著促进胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422的迁移能力(P<0.05)。6.transwell侵袭实验结果显示敲低NETO2显著抑制胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422的侵袭能力(P<0.05),而过表达NETO2则显著促进胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422的侵袭能力(P<0.05)。7.裸鼠腹腔转移模型结果显示敲低NETO2显著抑制胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422的体内转移能力(P<0.05),而过表达NETO2则显著促进胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422的体内转移能力(P<0.05)。此外,HE染色证实了转移瘤是胃癌细胞所形成。8.在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低NETO2使胃癌细胞由间质样形态变为上皮样形态,而过表达NETO2则使胃癌细胞由圆形变为纺锤形,且细胞突起显著增多。9.Western blotting及qRT-PCR实验结果显示在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低NETO2显著促进E-cadherin的表达,并且显著抑制N-cadherin、Snail及ZEB1的表达,表明上皮-间质转化被显著抑制。10.基因芯片及IPA分析显示,在胃癌细胞系MGC803中敲低NETO2后,共有1243个基因的表达发生显著改变(|log FC|≥1.5,FDR<0.05),其中上调基因580个,下调基因663个。疾病状态改变最明显的是肿瘤,而细胞功能改变最显著的是细胞侵袭、迁移和上皮-间质转化。与肿瘤相关的改变最明显的信号通路是PI3K/AKT信号通路(z值=-2.111,p=0.0269)。11.在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低NETO2显著抑制p85及AKT的磷酸化水平,而过表达NETO2则显著促进p85及AKT的磷酸化水平,表明PI3K/AKT信号通路参与了NETO2对胃癌细胞侵袭转移的调控。12.使用PI3K抑制剂LY294004及AKT抑制剂MK2206处理胃癌细胞,可显著逆转NETO2过表达所导致的侵袭能力及AKT磷酸化水平的增高、N-cadherin表达的上调及E-cadherin表达的下调。外源性转染持续活化状态的AKT则逆转了由NETO2敲低所导致的侵袭能力的下降、N-cadherin表达水平和AKT磷酸化水平的降低,以及E-cadherin表达的上调。13.敲低NETO2抑制了NF-κB p65、IKKβ和IκBα的磷酸化,过表达NETO2则可显著提高p65的核积累。双荧光素酶报告基因实验的结果说明过表达NETO2显著促进了NF-κB的转录活性,而敲低NETO2则可显著抑制NF-κB的转录活性。14.使用TNF-α(NF-κB激动剂)处理细胞可逆转NETO2敲低所导致的Snail表达水平及p65磷酸化水平的降低以及NF-κB转录活性的抑制作用。使用JSH-23(NF-κB抑制剂)或Bay 11-7082(NF-κB抑制剂)处理细胞可以逆转NETO2过表达所促进的EMT表型转化,Snail表达的增高以及NF-κB转录活性和胃癌细胞侵袭能力的增强。15.IPA分析结果显示TNFRSF12A在NETO2敲低后表达显著降低(降低倍数3.03倍,p<0.0001),在Western blotting及qRT-PCR实验结果中发现,在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低NETO2可显著抑制TNFRSF12A的表达,而过表达NETO2则可显著促进TNFRSF12A的表达。16.在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中敲低TNFRSF12A可显著抑制AKT、p85及p65的磷酸化,降低p65入核量。此外,敲低TNFRSF12A可显著抑制NF-κB的转录活性。17.在胃癌细胞系MGC803及原代胃癌细胞XN0422中过表达NETO2的同时敲低TNFRSF12A可显著逆转NETO2过表达导致的AKT、p85和p65磷酸化水平的增高、p65入核量的增加及NF-κB转录活性的增强。研究结论:1.NETO2在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织,NETO2的表达同胃癌患者的TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及肿瘤大小显著正相关,同患者的总生存率及无病生存率显著负相关,是胃癌患者的独立预后因素。2.NETO2在胃癌细胞中高表达可增强胃癌细胞的迁移、侵袭、转移能力。3.NETO2通过促进胃癌细胞上皮-间质转化而促进胃癌细胞侵袭转移。4.NETO2通过激活PI3K/AKT信号通路促进胃癌上皮-间质转化。5.NETO2通过PI3K/AKT激活NF-κB/Snail轴在胃癌中发挥促癌作用。6.NETO2对PI3K/AKT/NF-κB/Snail轴的激活作用由TNFRSF12A介导。