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目的:
1、建立心肌细胞的培养方法，研究贯叶金丝桃苷(Hypericumperforatum glycosides，Hyp)对心肌细胞的毒性作用，以确定Hyp的给药浓度范围。
2、研究Hyp对过氧化氢(H2O2)所致乳鼠心肌细胞损伤的生化指标及相关基因表达的影响，以确定其抗心肌氧化应激损伤的作用机制。
方法:
1、体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞，通过形态学观察、搏动自律性及免疫组化等方法鉴别心肌细胞。选取搏动良好的细胞，随机分为8个组:正常对照(Control)组、二甲基亚砜溶媒(DMSO)组、Hyp各浓度组(10、5、1、0.2、0.04和0.08g/L)，采用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测各Hyp给药组对心肌细胞的毒性作用;观察Hyp对心肌细胞的搏动频率的影响。
2、体外培养原代SD大鼠乳鼠心肌细胞，实验选取搏动良好的细胞，随机分成7组:正常对照(Normal)组，H2O2损伤模型(Model)组，DMSO溶媒组(DMSO)，Hyp低剂量(Low)组，Hyp中剂量(Middle)组，Hyp高剂量(High)组，阳性药物(Verapamil)组。除正常对照组外，其余各组均利用H2O2诱导损伤建立乳鼠心肌细胞氧化应激损伤模型，MTT法检测氧化应激损伤心肌细胞活力，按试剂盒说明测定氧化应激损伤心肌细胞的LDH、cNOS、iNOS、tNOS、cTnI、CK-MB活性、损伤心肌细胞中Na+-k+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性;RT-PCR法测定Hyp对不同亚型NOSmRNA表达的影响。
结果:
1、经细胞形态学，心肌细胞搏动情况及免疫组化等鉴别心肌细胞，结果显示纯度高;Hyp对体外培养心肌细胞的TC50=8.946g/L,TC0=O.028g/L，将Hyp以TC0稀释浓度给药对心肌细胞的搏动无影响，小于或等于TC0浓度给药对心肌细胞的毒性很低。
2、Hyp低、中、高剂量组的H2O2损伤后心肌细胞活力高于H2O2损伤模型组(P＜O.O1);与模型组相比，Hyp中、高剂量组的iNOS、LDH明显下降(P＜O.O1)，cNOS、tNOS的活性明显增高(P＜O.O1);Hyp中、高剂量组的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显高于模型组(P＜O.O1);与模型组相比较，Hyp各浓度组均可上调nNOSmRNA表达(P＜O.O1),Hyp高剂量组、Hyp中剂量组对eNOSmRNA、iNOSmRNA、表达均具有显若的上调作用(P＜O.O1)，而Hyp低剂量组对eNOSmRNA、iNOSmRNA表达影响与模型组的相比无差异(P＞O.05)。
结论:
1、Hyp对体外原代培养的心肌细胞毒性很低。
2、Hyp可以抗氧化应激损伤，保护心肌细胞，可能与提高ATP酶活性，选择性阻滞钙内流，抑制钙超载，调节不同亚型NOSmRNA，控制不同亚型NOS蛋白表达有关。
1、建立心肌细胞的培养方法，研究贯叶金丝桃苷(Hypericumperforatum glycosides，Hyp)对心肌细胞的毒性作用，以确定Hyp的给药浓度范围。
2、研究Hyp对过氧化氢(H2O2)所致乳鼠心肌细胞损伤的生化指标及相关基因表达的影响，以确定其抗心肌氧化应激损伤的作用机制。
方法:
1、体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞，通过形态学观察、搏动自律性及免疫组化等方法鉴别心肌细胞。选取搏动良好的细胞，随机分为8个组:正常对照(Control)组、二甲基亚砜溶媒(DMSO)组、Hyp各浓度组(10、5、1、0.2、0.04和0.08g/L)，采用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测各Hyp给药组对心肌细胞的毒性作用;观察Hyp对心肌细胞的搏动频率的影响。
2、体外培养原代SD大鼠乳鼠心肌细胞，实验选取搏动良好的细胞，随机分成7组:正常对照(Normal)组，H2O2损伤模型(Model)组，DMSO溶媒组(DMSO)，Hyp低剂量(Low)组，Hyp中剂量(Middle)组，Hyp高剂量(High)组，阳性药物(Verapamil)组。除正常对照组外，其余各组均利用H2O2诱导损伤建立乳鼠心肌细胞氧化应激损伤模型，MTT法检测氧化应激损伤心肌细胞活力，按试剂盒说明测定氧化应激损伤心肌细胞的LDH、cNOS、iNOS、tNOS、cTnI、CK-MB活性、损伤心肌细胞中Na+-k+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性;RT-PCR法测定Hyp对不同亚型NOSmRNA表达的影响。
结果:
1、经细胞形态学，心肌细胞搏动情况及免疫组化等鉴别心肌细胞，结果显示纯度高;Hyp对体外培养心肌细胞的TC50=8.946g/L,TC0=O.028g/L，将Hyp以TC0稀释浓度给药对心肌细胞的搏动无影响，小于或等于TC0浓度给药对心肌细胞的毒性很低。
2、Hyp低、中、高剂量组的H2O2损伤后心肌细胞活力高于H2O2损伤模型组(P＜O.O1);与模型组相比，Hyp中、高剂量组的iNOS、LDH明显下降(P＜O.O1)，cNOS、tNOS的活性明显增高(P＜O.O1);Hyp中、高剂量组的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显高于模型组(P＜O.O1);与模型组相比较，Hyp各浓度组均可上调nNOSmRNA表达(P＜O.O1),Hyp高剂量组、Hyp中剂量组对eNOSmRNA、iNOSmRNA、表达均具有显若的上调作用(P＜O.O1)，而Hyp低剂量组对eNOSmRNA、iNOSmRNA表达影响与模型组的相比无差异(P＞O.05)。
结论:
1、Hyp对体外原代培养的心肌细胞毒性很低。
2、Hyp可以抗氧化应激损伤，保护心肌细胞，可能与提高ATP酶活性，选择性阻滞钙内流，抑制钙超载，调节不同亚型NOSmRNA，控制不同亚型NOS蛋白表达有关。