第一部分:miR-328在椎间盘退变中的作用及其相关机制研究研究背景椎间盘退变是导致腰腿痛的主要原因之一,它不仅给患者的生活带来问题,而且给公共卫生系统带来极大的负担。据不完全统计,大约40%的30岁以下的人有椎间盘退变的症状,而这个数字在50岁以上的人中则达到了 90%。目前椎间盘退变的发病机制尚不明确,科学界对于其发生机制存在多种学说。从解剖生理学角度,椎间盘由纤维环和髓核两部分组成,其外层结构主要是致密的纤维环(annulus fibrosus,AF)组成,中层为胶冻状的髓核(Nucleus pulposus,NP)组织,上下面覆盖终板。目前的主流学说认为,造成椎间盘退变的主要原因,是由于椎间盘上下面的终板发生了钙化,引起了营养物质输送的障碍,导致髓核细胞营养不足,产生了异常的凋亡,从而导致了该疾病的发生。因此,通过研究髓核细胞退变的相关机制,并筛选出可靠的特异性靶点,可以更好的为椎间盘退变的基础研究及临床治疗提供更多的理论依据及全新的治疗方法。近年来,人们对微小RNA(miRNAs)在各种疾病中的作用进行了大量的研究。miRNAs是一类小分子非编码RNA的统称,其长度约为20～22个核苷酸,与mRNA通过转录编码蛋白的作用相反,miRNA主要的作用是通过直接切割或者靶向与其3’-非编码区域互补的mRNA,从而对其靶基因的表达进行负调控。越来越多的证据表明,miRNAs可能参与多种疾病的发生和发展,如心血管疾病、癌症、自身免疫性疾病等。miRNAs在骨和软骨发育以及骨科疾病(如骨关节炎、骨肉瘤)中的作用也被讨论过。在椎间盘退变的领域,miRNA的作用已有相关报道。在一项最新的研究中,研究者通过测序的方法比较椎间盘退变患者与正常人椎间盘组织患者组织中miRNA的表达发现,miR-328在椎间盘退变组织中的表达异常上调,然而相关的机制仍不清楚。P-21蛋白激酶6(p21-activated kinases,PAK6)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在之前的研究中,研究者发现其参与调控各种细胞生物学过程,例如细胞的增殖与凋亡,细胞骨架的重排、NADPH氧化酶活性的调控、丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活等。目前关于PAK6的研究多集中于肿瘤领域,PAK6被发现在多种肿瘤中异常高表达,包括前列腺癌,肝癌,子宫内膜腺癌,非小细胞肺癌,结肠癌等,研究发现抑制PAK6可以促进癌细胞的凋亡,抑制其增殖,并且可以有效提高了癌细胞对化疗药物的敏感性,而过表达PAK6则可以促进细胞的增殖,抑制其凋亡。通过生物信息学方法,PAK6被预测为miR-328的直接靶点,而在椎间盘退变的相关研究中,PAK6的作用则尚未见报道。因此,在本项研究中,我们将初步探讨miR-328及其靶基因PAK6在椎间盘退变发病机制中的作用。我们将通过建立大鼠椎间盘退变模型的方法,比较miR-328及PAK6在正常髓核细胞及椎间盘退变大鼠髓核细胞中的表达水平;此外,我们还将原代培养正常大鼠椎间盘髓核细胞,并向其中转染miR-328的模拟物和抑制物,以明确miR-328是否通过靶向PAK6调控大鼠椎间盘髓核细胞增殖凋亡的相关机制,为椎间盘退变的治疗提供新的理论依据及特异性靶点。目的:已经讨论过microRNAs参与椎间盘退变(IDD)的发病机制,但miR-328在IDD中的作用仍有待进一步研究。实验方法:1)椎间盘退变实验动物的模型建立选取健康的Wista大鼠,采用穿刺法建立大鼠椎间盘退变模型,其具体步骤如下:首先将大鼠麻醉(腹腔注射3%戊巴比妥钠,计量为40mg/kg),待麻醉成功后,将其四肢固定,俯卧于手术台,使用Faxitzon仪对大鼠进行X线造影以明确其腰椎的节段,之后根据造影结果,选取大鼠的4-5腰椎间盘,确定位置后,使用20ml注射器的针头进行腰椎部位的穿刺,以通过机械损伤的方法,造成其椎间盘的退变。两周后,使用MRI对实验大鼠椎间盘退变的程度进行判定。2)原代退变髓核细胞的分离及培养确定椎间盘退变模型建立成功后,将模型鼠麻醉,固定四肢,俯卧于手术台。切开皮肤后,将其腰椎剪断,分离其中的细胞,加入培养基后制成单细胞悬液。之后采用差异贴壁培养法对细胞进行纯化,以获得原代的退变髓核细胞。原代培养成功后,将细胞进行苏木精-伊红染色,通过观察细胞的形态、聚集情况,对髓核细胞进行形态学鉴定。3)荧光定量实时PCR法检测大鼠椎间盘组织髓核细胞中椎间盘退变相关标志物以及miR-328的表达情况收集原代分离的退变髓核细胞,并原代培养正常的髓核细胞,使用Trizol试剂,提取细胞中的总RNA,通过反转录将RNA反转为cDNA,之后采用荧光定量PCR的方法,比较退变与未退变髓核细胞中特异性标志物I型胶原、II型胶原、IV型胶原,以及目标miRNA miR-328 mRNA水平的表达。4)蛋白免疫印迹法检测大鼠椎间盘组织髓核细胞中椎间盘退变相关标志物的表达情况收集原代分离的退变髓核细胞,并原代培养正常的髓核细胞,提取其中的总蛋白,之后采用蛋白免疫印迹法,比较退变与未退变髓核细胞中特异性标志物I型胶原、II型胶原、IV型胶原等蛋白水平的表达。5)MTT法检测miR-328对髓核细胞增殖的影响原代培养正常的髓核细胞,使用脂质体将miR-328的模拟物以及抑制物转染进入髓核细胞,培养72小时后,采用MTT法比较未转染组,miR-328类似物转染组,及miR-328抑制物转染组细胞的增殖情况。6)流式细胞术检测miR-328对髓核细胞凋亡的影响原代培养正常的髓核细胞,使用脂质体将miR-328的模拟物以及抑制物转染进入髓核细胞,培养72小时后,采用流式细胞术比较未转染组,miR-328类似物转染组,及miR-328抑制物转染组细胞的凋亡的情况。7)荧光定量实时PCR法检测转染后PAK6及增殖凋亡相关分子在髓核细胞中mRNA水平的表达情况将miR-328的模拟物以及抑制物转染进入髓核细胞,培养72小时后,收集细胞,提取RNA并进行荧光定量实时PCR,比较各组中PAK6以及增殖凋亡相关分子,如Bax、Bcl-2、Caspase-3 等 mRNA 水平的表达。8)蛋白免疫印迹法检测转染后PAK6及增殖凋亡相关分子在髓核细胞中蛋白水平的表达情况将miR-328的模拟物以及抑制物转染进入髓核细胞,培养72小时后,收集细胞,提取细胞中蛋白,通过蛋白免疫印迹法比较各组中PAK6以及增殖凋亡相关分子,如Bax、Bcl-2、Caspase-3等蛋白水平的表达。9)双荧光素酶报告实验验证miR-328与PAK6的靶点关系培养293细胞,设计野生型及突变型含有miR-328与PAK6 3’非编码区互补序列的质粒,将其与miR-328模拟物共同转染至293细胞,采用双荧光素酶报告实验的方法,验证miR-328与PAK6的直接靶向关系。结果:1.miR-328在正常大鼠和大鼠IDD模型中表达的比较用RT-qPCR方法检测miR-328在椎间盘正常大鼠和IDD大鼠中的表达。与对照组相比,IDD大鼠椎间盘miR-328表达明显升高(p<0.05)2.miR-328对NP细胞增殖和凋亡的影响转染miR-328模拟物后,NP细胞在不时间点的增殖显著降低,而转染miR-328抑制物后,NP细胞在24和48 h内增殖显著增加;另一方面,转染miR-328模拟物后,NP细胞凋亡率显著增加,而转染miR-328抑制物则可以抑制NP细胞的凋亡(p<0.05)。3.PAK6是miR-328的直接靶点miR-328模拟物对突变型PAK6 3’-UTR(MUT)转染的细胞中荧光素酶的活性没有显著影响(p>0.05),而miR-328模拟物可导致野生型PAK6 3’-UTR(WT)转染细胞的荧光素酶活性显著降低。这些结果表明PAK6是miR328的直接靶点。4.miR-328可通过靶向PAK6调节NP细胞的增殖和凋亡IDD大鼠椎间盘PAK6的表达显著降低(p<0.05);此外,在NP-细胞中转染miR3-28模拟物可导致PAK6的表达显著降低,而miR-328抑制剂的转染则导致PAK6的水平升高。此外,转染miR-328模拟物可导致促凋亡蛋白caspase-3、bax的表达显著增加,抗凋亡蛋白bcl-2的表达明显降低,而转染miR-328抑制剂的则起到了相反的作用(p<0.05)。结论:miR-328在IDD中上调;此外,miR-328可能通过靶向PAK6调控NP细胞的增殖和凋亡。第二部分:三七总皂苷通过抑制IL-1 β及NF-KB相关信号通路延缓椎间盘退变的相关机制研究研究背景椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IDD)是一种常见的脊柱疾病。近年来,随着生活节奏的不断加快以及不良生活习惯的养成,目前该病的发生与发展呈现高发以及年轻化的趋势,有报道称在30岁以下的人群中,该病发生的比例高达40%,而一旦超过50岁,则这个比例更会高达90%。随着椎间盘功能的不断恶化,该病则会进一步发展为椎间盘突出、椎管狭窄、脊柱弯曲等更为严重的疾病,对患者的身心健康产生极大影响的同时,也会给患者带来巨大的经济负担。目前,椎间盘退变的相关机理研究尚不明确。现有临床治疗包括保守治疗(例如卧床休息、抗炎止痛、理疗)和手术治疗。保守治疗一般能够缓解患者急性的疼痛,但如果保守治疗失败,必须行手术治疗,手术治疗主要考虑突出髓核切除术和椎间融合术。手术治疗能够达到一定的疗效,但费用高,感染风险较高,并且长期效果不肯定。因此,在椎间盘退变相关疾病的治疗领域,随着近年来相关机理的深入研究,如何建立更加安全有效的新型特效疗法是摆在医疗和科研工作者面前的一道难题。近年来,科学界对椎间盘退变发病机制进行了深入的探讨。目前的主流学说认为,椎间盘退变的进展可能会涉及一些促炎性细胞因子的异常表达其中白介素-1 β(IL-1β)的作用已经被广泛报导。IL-1 β的异常上调表达增加可诱导上调基质金属蛋白酶(MMPs)的表达,抑制抗凋亡基因BCL-2的表达,从而导致细胞的异常凋亡以及细胞外基质(ECM)的降解。NF-kB是一种最常见的核转录因子,其在各种免疫反应中扮演着极其重要的角色。在炎症反应中,NF-kB极其信号通路的活化或抑制会直接影响相关炎性因子的分泌及相关信号分子的表达,从而加速或抑制炎症反应的进程。然而,IL-1 β及NF-kB在椎间盘退变中发生发展的相关具体机制仍需要进一步的研究。长久以来,中药治疗一直是治疗椎间盘退变的重要手段。而近年来,随着学术界对祖国传统医学的研究的不断深入及再开发,中药的有效成分,例如中药单体在治疗椎间盘退变方面的效果及其相关机制研究的报道屡见不鲜。三七总皂苷是中药三七的主要有效成分,而三七自古以来就以活血化瘀的功效著称,因此,三七总皂苷在医疗领域具有极好的开发前景。目前的研究显示,三七总皂苷对于心脑血管疾病、肺炎、肝脏疾病、自身免疫性疾病等均有良好的疗效,而在骨科疾病中,三七总皂苷也被广泛应用与骨折、骨创伤、骨质疏松及软骨损伤的治疗中。研究发现,三七总皂苷可以通过激活或抑制细胞间的信号通路,促进骨以及软骨的生成,而动物研究的结果显示,三七总皂苷还可以有效调控动物体内的血液循环,并且具有抗血栓、抑制血小板的聚集以及扩张血管、增加血流量的功效。而这些过程可以有效的修复局部软组织的损伤、促进骨损伤处的愈合、增加骨密度并改善骨质疏松的状况,从而发挥其治疗效果。在目前的基础研究中,细胞实验与动物实验是最为常见的研究手段。其中,各种疾病动物模型的建立,在研究发病机制及药物疗效的临床前研究中发挥着极其重要的作用。而在椎间盘退变机制的相关研究中,由于临床标本获取困难,并且缺乏对照,因此,通过建立动物椎间盘退变模型可以很好的进行替代和补充,为该病病因和治疗方法的探索提供良好的研究手段。多年来,世界各地的研究者探索出大量用于建立椎间盘退变模型的方法,而其中,腰椎穿刺法是一种简单实用,且非常可靠的可以快速建立椎间盘退变模型的手段。目前该方法已被大量的文献报道,得到了国内外科研工作者的广泛认可。截至目前,三七总皂苷是否可以通过抑制IL-1β及NF-kB相关信号通路,从而延缓椎间盘退变的相关机制尚未见报道,因此,在此项研究中,我们将首次探讨三七总皂苷在治疗椎间盘退变中的潜在作用,通过建立椎间盘退变动物模型的方法,通过体内给药以及体外细胞实验的方法,探讨研究三七总皂苷治疗退变的腰椎间盘的潜在可能性,以及其可能的作用机制,为以后临床治疗椎间盘病变患者提供新的治疗思路和方法。目的:1)明确三七总皂苷是否可以通过抑制大鼠组织及血液中IL-1 β及其它炎性因子的表达,从而减缓椎间盘的退变。2)明确是否在细胞层面,三七总皂苷是否可以通过调控NF-KB相关的信号通路,抑制炎性因子的分泌及髓核细胞的退变。实验方法:1)大鼠椎间盘退变动物模型的建立将雌性Wistar大鼠随机分为5组,每组10只。包括假手术组、建模组、建模组+三七总皂苷低、中、高剂量组。采用腰椎穿刺法根据之前文献的报道建立大鼠椎间盘退变模型。将大鼠麻醉后,呈俯卧姿势固定于手术台上,使用Faxitzon仪确定其腰椎节段后,用20ml注射器针头刺穿其第4-5椎间盘,以模拟机械损伤下导致的椎间盘退变,假手术组仅将针头刺入皮下后便拔出。建模两周后,使用MRI的方法确定每只大鼠椎间盘的退变情况。2)三七总皂苷的给药方法待大鼠椎间盘退变模型成功建立后,假手术组及模型组仅以生理盐水进行每日灌胃,而三七总皂苷低、中、高组则分别按照10mg/(kg.d)、20mg/(kg.d)、40mg/(kg.d)的剂量进行给药,整个过程持续2周。治疗结束后处死大鼠,取下其椎间盘组织,并且剔除其周围多余的肌肉与脂肪,存在-800C冰箱备用。3)大鼠椎间盘组织中病理学检查及退变程度的判断使用HE染色方法对各组中椎间盘组织进行病理学检查,并采用RT-qPCR及Western blot方法检测组织中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅳ型胶原、蛋白多糖等的表达以判定组织中椎间盘退变的程度。4)大鼠组织及血清中炎性因子的表达情况分别使用免疫组化和ELISA方法检测各组中炎性因子的表达情况不同浓度处理组以及未处理组中炎性因子IL-1 β、IL-6等的表达情况。5)大鼠退变椎间盘组织髓核细胞的分离及原代培养及鉴定待大鼠椎间盘退变模型成功建立后,将大鼠麻醉后,大鼠麻醉后,呈俯卧姿势固定于手术台上,进行消毒后切开皮肤,剪断腰椎,收集细胞,之后将其置于培养瓶中,利用差异贴壁的方法进行培养纯化,并进行鉴定与培养。通过细胞H&E染色的方法对髓核细胞进行染色鉴定,使用免疫组化方法对各组中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅳ型胶原、蛋白多糖等的表达以判定各组细胞椎间盘退变的程度。6)大鼠退变椎间盘组织及髓核细胞中NF-kB相关信号通路相关信号蛋白的表达验证收集细胞培养上清液,使用ELISA方法检测各组中炎性因子IL-1 β、IL-6等的表达情况。此外,为了明确NF-kB信号通路是否参与这一过程,我们将采用RT-PCR和Western blot的方法,分别检验第一部分中的组织和第二部分细胞中检测比较各组中NF-kB及其相关信号蛋白,如MMP-9,Bcl-2等的表达,以明确NF-kB相关信号通路是否在三七总皂苷改善腰椎间盘退变的相关机制中发挥重要的作用。结果:1.三七总皂苷处理对IDD模型大鼠的影响PNS处理后,Ⅰ型胶原和GAG的表达明显降低,而Ⅱ型胶原的表达在mRNA和蛋白水平均显著增加;ELISA法检测了各组大鼠血清中IL-1 β和IL-6的表达,PNS可显著降低IDD大鼠血清中IL-1 β和IL-6的表达(p<0.05),而该抑制作用具有剂量依赖性。2.三七总皂苷在体外对髓核细胞的影响从正常大鼠和IDD大鼠中分离了髓核细胞,并检测了 PNS对NP细胞的影响。发现20、50mg/L PNS处理显著降低IDD大鼠髓核细胞培养上清液中IL-1 β和IL-6的分泌(p<0.05)。3.三七总皂苷对IDD大鼠体内及IDD大鼠髓核细胞中NF-κ B相关信号分子表达的影响大剂量、高剂量的PNS治疗可显著降低IDD大鼠体内NF-kB、MMP-9的表达,同时在体外实验中,PNS也可显著降低IDD大鼠NP-细胞中NF-kB、MMP-9的水平(p<0.01)。PNS处理导致IDD大鼠椎间盘组织中I型胶原和GAG表达明显降低,Ⅱ型胶原表达明显增加,大鼠血清中IL-1 β和IL-6的表达增加;体外培养NP细胞,用PNS处理细胞后,其培养上清液中IL-1 β和IL-6也减少;RT-qPCR和Western blot检测结果显示,中、高浓度的PNS对Bcl-2的表达有明显的促进作用,而对MMP-9和NF-KB的表达则有显著的抑制作用。结论:PNS可通过调节IL-1 β/NF-KB信号通路减缓椎间盘退变。