背景与目的精神分裂症(Schizophrenia)是一种影响思维、感觉、心境和社会性的复杂而严重的精神疾病,多在青壮年缓慢或亚急性起病,全球发病率接近1%。临床症状上由譬如幻觉、妄想、怪异行为的阳性症状,以及情感低落、快感缺乏、刻板思维、社交退缩等阴性症状构成,并可伴有认知功能损害症状。这些精神症状表现和神经系统功能往往是难以分开的,比如γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)能系统假说就认为,精神分裂症患者存在GABA能低下,精神分裂症恶化可能是GABA递质逐步缺乏的表现,且与精神分裂症阴性症状和认知损害症状相关。GABA是脊椎动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质,由谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸脱羧而合成,再经囊泡释放,激活突触后神经元细胞膜上的受体发挥作用,此外释放于细胞间的递质还需要由GABA运载体(GABA Transporter, GAT)及时再摄取,这整个过程称为GABA能的传递。突触后神经元细胞膜上的GABA受体有A、B两型,A型GABA受体属于离子通道型受体,是由α1-α6、β1-β3、γ1-γ3、ρ1-ρ3、π、ε、δ和0多个亚基组成的五聚体复合物,其中α1、β2、γ2亚基是构成功能性受体的主要组分；介导GABA能快速突触反应。B型GABA受体属于G-蛋白耦合受体,是由GABBR1和GABBR2组成的二聚体复合物；介导GABA能缓慢突触反应。在此GABA能的传递通路中,我们最关注的是编码GABA (A)受体β2亚基的GABRB2基因,并已经通过病例对照研究、细胞实验,及小鼠实验发现了其DNA多态性、mRNA表达异常、蛋白受体功能受损以及表观修饰异常都可能与精神分裂症有关；该通路中的GAD1, GAD2基因同样有着充足的精神分裂症易感性证据,三者均被收录于SZgene论坛数据库中；而GAT1基因作为编码脑内转运GABA的GAT蛋白最主要的基因,也有部分与精神分裂症相关的报道。精神分裂症致病是由遗传和环境因素共同起作用,并由表观调控介导的。上述基因中,对GAD1基因的表观调控研究相对较多,有小鼠实验发现表观药物甲硫氨酸(L-Methionine, MET)暴露可诱导产生精神分裂症类似行为,并伴随着RELN和GADl基因启动子区高甲基化改变,且通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(Valproate acid, VPA)干预,在逆转异常行为的同时降低了RELN的甲基化。而我们对GABRB2基因的前期实验结果也显示,在临床精神分裂症患者中,GABRB2基因内含子8和9上的疾病相关SNP存在基因印迹现象,是精神分裂症患者中出现基因型依赖性RNA表达降低的表观调控机制；此外我们还发现精神分裂症患者GABRB2基因启动子区存在显著的高甲基化现象。斑马鱼是一种近年发展迅速的模式生物,与人类基因组高度同源,体型小、易养殖、易操作、易观察,还具有类似人类的脑组织形态划分,并存在着保守的精神行为调控机制,非常适合用于神经精神疾病的研究。具体到GABA能系统,斑马鱼作为脊椎动物,亦以GABA作为抑制性神经递质,此外,有针对小脑的研究证实斑马鱼GABA能系统,包括GAD蛋白和GABA受体的分布均与哺乳动物一致,且GABA A受体同样也可介导快速抑制性突触传递。目前利用斑马鱼研究精神疾病最成功的例子是抑郁症,已经实现了多种方法建模及相对完整的行为学检测体系,主要是新鱼缸实验,黑白箱实验加上其他实验；并可通过检查压力应激轴(HPA轴)和5-HT系统通路的改变(即检查皮质醇和5-HT含量的改变)进行生物学验证；下一步便可以应用该斑马鱼模型进行抗抑郁药物筛选工作了。而对于斑马鱼精神分裂症建模,据我们了解,现有为数不多的研究都是应用地卓西平马来酸盐(+MK-801)拮抗谷氨酸受体NMDA来进行的。综上所述,我们希望通过本研究揭示模式生物斑马鱼中gabrb2基因的发育生物学信息,尤其是甲基化调控信息；再利用表观药物MET暴露构建斑马鱼精神分裂症行为学模型,并系统检测gabrb2基因(GABRB2同源基因)和其他联系紧密的GABA能传递通路基因(gad1b, GAD1同源基因；gad2, GAD2同源基因；slc6a1b, GAT1同源基因)的甲基化及表达改变,以期对模型背后机制进行解释,并进一步为精神分裂症发生或发展的监测、治疗药物的开发提供靶点。材料与方法1.实验动物：本课题所用野生型AB系斑马鱼,全部由南方医科大学发育生物学教研室提供；其中,6-18月龄的成鱼用于普通交配产卵；6-11月龄的成鱼用于药物处理及后续试验,并使雌雄比例均衡。2.实验方法：(1)斑马鱼的饲养：斑马鱼饲养在专门的鱼房中,参照Westerfield的方法进行。重要参数如下：鱼房昼夜光照周期为日：夜=14：10,反渗透净水机制备的养鱼系统水,保持pH值7.2-7.6,水温28.5-29.5℃,电导率450-550μs/cm。(2)斑马鱼发育过程中甲基化图谱的构建：先进行限制性内切酶酶切,再结合荧光偏振的方法(FPDM)检测全基因组甲基化；结合荧光定量PCR的方法检测gabrb2基因启动子区甲基化。(3)斑马鱼发育过程中gabrb2 mRNA表达图谱的构建：先提取总RNA后逆转录为总cDNA,再应用荧光定量PCR的方法检测。(4)斑马鱼神经发育过程中gabrb2在脑组织内的定位：先需设计构建gabrb2基因的反义RNA探针,收集斑马鱼几个重要神经发育时间点的胚胎,以及6 dpf之前的幼鱼,再使用整体原位杂交技术定位基因表达。(5)斑马鱼成鱼药物处理：采用浸泡给药,所用表观药物MET参考Vuaden的实验,并增加了一个浓度,最终以低中高三个浓度：1.5 mM,3.0 mM,6.0 mM,以及不加药物的空白对照,连续处理7天,每天换药。(6)斑马鱼行为学检测：进行了三种行为学实验,包括检测基本精神状况及自发运动的新鱼缸实验(Novel tank test),检测社交行为检测的社交趋避实验(Social interaction test),以及检测认知行为的T迷宫实验(T-maze tank test)。三种实验时间均需控制在当日光照后的4.5-9小时内进行(13：00-18：00),实验开始前,先将受试鱼转移至行为学检测所用场地,并给予受试鱼30 min时间来适应周围环境。三种实验均采用先录制后分析的方式,前两种通过Etho Vision2.1软件进行分析,T迷宫实验则由培训过的研究人员通过盲法人为分析。(7)斑马鱼MET暴露后全基因组及GABA能传递相关基因的甲基化及mRNA表达分析：方法同发育过程中的相应检测,但基因除了gabrb2再加上gad1b, gad2和slc6a1b。3.统计方法：斑马鱼发育过程中全基因组甲基化、gabrb2基因启动子区甲基化和mRNA表达、新鱼缸实验、MET处理后各基因的启动子区甲基化和mRNA表达,依据方差齐性检验选用方差分析(ANOVA)或布朗分析(Brown-Forsythe analysis),并相应附以LSD或Dunnett T3的后检验；社交趋避实验、T-迷宫实验采用独立样本的t检验进行分析；甲基化和表达的相关性采用Spearman相关分析；p值小于0.05认为有统计学差异。实验结果1.斑马鱼全基因组甲基化水平随着发育而持续增加,尤其是8-16 hpf的神经系统发育早期,与0-4 hpf的神经系统发育准备期相比,甲基化提升最明显,约增加了一倍,之后甲基化水平基本稳定,提升程度有限。2.斑马鱼gabrb2基因启动子区甲基化水平随着发育而降低,检测的两个CCGG位点得到的结果均是如此,但距离转录起始点(TSS)-1336 bp位置的CCGG变化更明显。而斑马鱼gabrb2基因mRNA表达在发育初始有一短暂下调,随后持续升高,且成鱼比幼鱼要高很多,转折点在16 hpf-24 hpf间,且明显升高出现在2dpf后,即GABA能神经元出现,分泌GABA神经递质后。3.整体原位杂交结果显示gabrb2从24 hpf开始,随着大脑形态分化,出现特异信号,定位于前脑、中脑、中脑后脑边界,2 dpf开始在后脑也出现表达,且3 dpf-6 dpf斑马鱼大脑形态和gabrb2表达定位都非常稳定。4.行为学实验显示,高剂量MET暴露诱发了斑马鱼社交障碍和学习记忆障碍,这是精神分裂症的核心阴性症状和认知损害症状的表现；并降低了斑马鱼的焦虑水平,但未改变其自发运动模式。5.MET暴露广泛升高了全基因组和4个目标基因启动子区的甲基化水平,尤其是gabrb2-1336和gad1b-1397 CCGG位点。但即使是高剂量MET暴露,仍然未能引起GABA能传递系统4个目标基因mRNA表达显著下调。6.相关分析显示,斑马鱼发育过程中gabrb2 -1336 CCGG位点甲基化与其mRNA表达整体上呈负相关(尤其是经过表达转折点后),而MET暴露后相关性消失;gad1b-1397 CCGG位点甲基化受MET提升明显,与其表达同样不相关。结论1.发育过程中,斑马鱼gabrb2启动子区(尤其是-1336 CCGG位点)甲基化总体上负向调控mRNA表达,尤其是GABA能神经元出现后。2.高浓度MET暴露能在野生型AB系斑马鱼中模拟精神分裂症阴性症状和认知损害症状,以此构建精神分裂症模型。3.gabrb2及gad1b的表观失调(主要表现在gabrb2-1336 CCGG位点和gnd1b-1397 CCGG位点的甲基化失调),加上各GABA能传递相关基因启动子区的异常高甲基化,可能共同引起精神分裂症的阴性症状和认知损害症状发生。